综合图区亚洲网友自拍|亚洲黄色网络|成人无码网WWW在线观看,日本高清视频色视频kk266,激情综合五月天,欧美一区日韩一区中文字幕页

English | 中文版 | 手機(jī)版 企業(yè)登錄 | 個(gè)人登錄 | 郵件訂閱
當(dāng)前位置 > 首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 用冰凍切片做多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)的實(shí)驗(yàn)操作步驟

用冰凍切片做多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)的實(shí)驗(yàn)操作步驟

瀏覽次數(shù):1406 發(fā)布日期:2023-9-18  來(lái)源:absin

一、前言:

多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)主要的技術(shù)原理來(lái)自TSA技術(shù),TSA即酪酰胺信號(hào)放大,是一類(lèi)利用辣根過(guò)氧化酶(HRP)對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法。用這種方法做多重?zé)晒馊旧抢枚股蠋в械腍RP(而不是直接偶聯(lián)熒光素),來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素,該熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián),使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后進(jìn)行微波處理,前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉,共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育,周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束,熒光素都結(jié)合好后,最后去檢測(cè)結(jié)果。

 

因?yàn)樯婕暗蕉啻挝⒉,似乎也只有石蠟切片能?jīng)得起這番造作,而手中只有冰凍樣本的老師,以往只能望洋興嘆,因?yàn)楸鶅銮衅?jīng)不起甚至一輪的熱處理。但隨著技術(shù)的發(fā)展,這個(gè)難題也在逐漸被攻克,為了使得更多老師能夠用上mIHC這項(xiàng)技術(shù),Absin推出了抗體洗脫液(abs994),現(xiàn)在一起來(lái)看看冰凍切片的多色實(shí)驗(yàn)該如何開(kāi)展吧~

 

二、建議操作步驟:

1、樣本準(zhǔn)備

1)固定包埋:獲取新鮮組織,用4%多聚甲醛低溫固定,PBS緩沖液洗三次,每次15min;30%蔗糖沉降脫水,OCT包埋;
2)切片:使用冷凍切片機(jī),將組織冰切成3-5μm的切片(對(duì)于儲(chǔ)存在-80℃下的組織,制備切片前,需轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱中平衡約15min),粘貼于防脫載玻片上,室溫晾片30-60min。切片放入PBS中浸洗3次,每次5min,去除OCT;
3)淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:滴加3% H2O2,室溫下孵育10-30min,PBS浸洗5min×3次。


2、多色實(shí)驗(yàn)
1)封閉:滴加封閉液,室溫孵育30min,除去封閉液;
2)一抗孵育:棄封閉液,滴加稀釋好的的一抗工作液,于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜或37℃ 1-2h(濕盒中可加少量水,防止抗體孵育過(guò)程干片),PBS浸洗5min×3次;
3)二抗孵育:滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP二抗覆蓋組織,避光室溫孵育20-50min,PBS浸洗5min×3次;
4)染料孵育:滴加現(xiàn)配的1*TSA染料工作液(使用信號(hào)放大液按1:100稀釋?zhuān),反?yīng)2-15min,PBS浸洗5min×3次;
5)抗體洗脫:滴加適量37℃預(yù)熱至完全溶解的抗體洗脫液(abs994)覆蓋樣本,10s后甩去,再次滴加抗體洗脫液沒(méi)過(guò)整個(gè)樣本并稍微鼓起,37℃濕盒孵育5-20min(根據(jù)切片厚度,一抗種類(lèi)調(diào)整洗脫溫度和時(shí)間,洗脫難度:結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白>胞漿蛋白>胞核蛋白),PBS浸洗5min×3次;
6)重復(fù)進(jìn)行[1封閉→5抗體]洗脫過(guò)程,直到完成所有指標(biāo)染色;
7)滴加1*DAPI工作液到樣品上,浸沒(méi)樣本區(qū)域,室溫孵育10min,PBS浸洗5min×3次;
8)滴加抗熒光淬滅封片劑,用蓋玻片封片,避免氣泡;
9)掃描成像,數(shù)據(jù)分析。

 

三、注意事項(xiàng):

1、若某些抗體難以洗脫,建議降低一抗稀釋比例,或?qū)⒃摪悬c(diǎn)排到最后一輪進(jìn)行染色;
2、抗體洗脫液在使用時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整孵育時(shí)間和洗脫溫度,若時(shí)間太長(zhǎng)有可能損傷抗原靶點(diǎn)以及細(xì)胞核形態(tài);
3、請(qǐng)?jiān)诎裰跋裙潭颖,切片后固定可能不耐受多次?biāo)記與洗脫;
4、冰凍切片請(qǐng)控制切片厚度不超過(guò)5um,太厚的樣本可能影響染色效果。

 

雖然抗體洗脫液解決了冰凍切片無(wú)法熱修復(fù)的問(wèn)題,但多輪洗脫依舊可能存在脫片的情況,可用白片進(jìn)行多次抗體洗脫判斷片子的耐受情況,來(lái)決定最終染色的靶點(diǎn)數(shù)量。

來(lái)源:愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司
聯(lián)系電話(huà):021-38015121
E-mail:info@absin.cn

用戶(hù)名: 密碼: 匿名 快速注冊(cè) 忘記密碼
評(píng)論只代表網(wǎng)友觀點(diǎn),不代表本站觀點(diǎn)。 請(qǐng)輸入驗(yàn)證碼: 8795
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話(huà):021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com