另一方面,內(nèi)毒素和帶陽離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)形成復合物以致親和配體和蛋白質(zhì)競爭內(nèi)毒素,如果在吸附劑表面的電荷密度高或者使用一種選擇配體,使得平衡傾向于吸附劑,則可使內(nèi)毒素得到去除。當帶陽離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)從陰離子交換劑上解脫時,能得到幾乎100%的蛋白質(zhì)。
迄今為止,以上所提及的吸附劑沒有一個已被實際用于蛋白質(zhì)溶液的內(nèi)毒素清除。但是,離子力起到了重要的作用,特別是在吸附過程的最初階段。低離子力的物質(zhì),相當于小于50mmol/L的NaCl,常被推薦用作離子交換劑。具有較高離子力的物質(zhì)如多黏菌素B和DAH,在被用作親和吸附劑時,與配體的結(jié)合主要依靠離子間作用力和疏水作用。在合適的條件下,其關(guān)系常數(shù)超過109。多陽離子配體較少依靠離子力。蛋白質(zhì)的去污染與其在環(huán)境條件下的等電點及pH值穩(wěn)定性有很大的關(guān)系。一般來說,當pH值接近蛋白質(zhì)的等電點時,內(nèi)毒素能最大限度地被去除。強堿或強酸性蛋白質(zhì)的化學特性使其在純化時發(fā)生不可逆的丟失,而且沉淀反應也是一個問題,所以必須尋找一個折中的辦法。對于酸性蛋白質(zhì)而言,環(huán)境pH值應該盡可能接近PI,同時應該采用多聚的或疏水性弱的配體。等電點接近7的蛋白質(zhì)應該在pH≈PI的環(huán)境下進行去污染。雖然用內(nèi)毒素選擇性配體能得到更好的結(jié)果,但陰離子交換劑也可以采用。離子交換劑對堿性蛋白質(zhì)的去污染結(jié)果也相當不錯,特別是帶有4條氨基酸基團的配體,它在堿性條件下能顯示出較高的離子密度,并在提高pH值后與內(nèi)毒素的吸附相當匹配。
應該注意到,不僅僅是帶凈電荷的蛋白質(zhì),也包括所有陽離子配體,其電荷密度隨著pH值的改變會發(fā)生變化,但除外那些有4條氨基酸的配體。pH值的升高可導致電荷密度的減少,具體數(shù)值可因配體的pK或pI而有差別。
如果內(nèi)毒素和帶負電荷的蛋白質(zhì)之間的作用是由Ca2+介導的,則應該輔以1~5mol/L的EDTA。EDTA是一種強螯合劑,可使蛋白質(zhì)-Ca2+-內(nèi)毒素復合物的平衡傾向于解離,由此增進吸附劑的去污效果.此外,如果要采用輔以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不帶電荷的去污劑,則應事先篩選,因為在應用這些物質(zhì)時會帶來其他問題。
評價層析柱在耗盡其蛋白質(zhì)結(jié)合能力之后留在柱里面的內(nèi)毒素的量是十分必要的,這在部分吸附時也是一樣的道理,即蛋白質(zhì)或內(nèi)毒素濃度的變化會同時影響到清除效率和蛋白質(zhì)的回收。