空間轉(zhuǎn)錄組測序

常見Q&A合集

Part.01 樣品

Q1：空間轉(zhuǎn)錄組適用的樣品類型？

新鮮樣本可以適用于多個物種，包括：人類、小鼠、大鼠、斑馬魚；FFPE樣本僅適用于人類和小鼠。

目前10x Genomics官方推薦的樣本物種包括：

新鮮樣本包括：人類（大腦、脊髓、心臟、乳房、乳腺、肺、淋巴結(jié)、腎臟、大腸-結(jié)直腸癌、卵巢、脾臟等）、鼠（大腦、眼睛、心臟、脊髓、股四頭肌、眼睛、肺、甲狀腺、肝臟、脾臟、胃、腎臟、大腸、小腸、睪丸、卵巢、嗅球、肱四頭肌、舌頭等）；  

FFPE樣本包括：人類（大腦、胸部、宮頸、心臟、脊柱、脊髓、肺、淋巴結(jié)、脾、前列腺、皮膚、腸、子宮等），小鼠（大腦、心臟、肝、脾、腎、睪丸、胸腺、胚胎、肌肉、子宮、胎盤、小腸、舌頭以及皮膚等）。

若樣本不在測試行列內(nèi)，則需要進行評估。

對于FFPE樣本，常規(guī)Visium只接收石蠟塊組織樣本；新推出的CytAssist產(chǎn)品可以兼容石蠟塊、白片、預貼片或預染色的石蠟切片（10x標準中推薦的載玻片貼片）以及組織芯片（TMA）等多種樣本類型。

Q2：確定做空間轉(zhuǎn)錄組的樣本應該怎么處理？

（1）對于新鮮組織，處理和保存方法如下：

先冷凍后包埋法：新鮮組織樣本取下后要迅速用預冷的鑷子將新鮮組織浸沒在異戊烷至組織完全冷凍，然后進行OCT包埋（盡量保持15min內(nèi)）。若無異戊烷，也可直接進行OCT包埋。公司官網(wǎng)（https://www.shbiochip.com/）提供詳細的OCT包埋教學視頻，同時也提供不同型號的包埋盒，可根據(jù)需要進行選擇。

🔸 樣本能否直接液氮凍存？

不可以液氮直接速凍，直接液氮處理可能在沸騰過程中使組織周圍形成空穴，導致不同區(qū)域降溫不同步而改變內(nèi)部形態(tài)，甚至組織碎裂。

🔸 若組織表面有血跡能否進行沖洗？

用預冷的PBS溶液或生理鹽水進行沖洗，但沖洗后需要用干凈的吸水紙吸干液體，防止形成冰晶，影響包埋。

（2）對于FFPE樣本，處理及運輸要求如下：

🔸 常規(guī)Visium ：

4℃密封保存運輸石蠟塊樣本（建議用包埋盒送樣，防止運輸過程中樣本損壞）。

🔸 CytAssist：

CytAssist不同類型FFPE樣本送樣要求

10x Genomics官方推薦的品牌玻片有效區(qū)域示意圖

🔸 若石蠟切片單個樣本切少于或超過5μm厚度，還能做空間轉(zhuǎn)錄組實驗嗎？

5μm是10x官方測試時采用并推薦的厚度，若實際組織超過或小于5μm，評估合格后也可做空間轉(zhuǎn)錄組，但可能會影響最終數(shù)據(jù)結(jié)果。

🔸 FFPE樣本想要做空間轉(zhuǎn)錄組測序，最多保存多久？

推薦是保存在一年之內(nèi)的樣本，若超過一年，可以先取少量樣本進行質(zhì)量評估，若質(zhì)檢合格，也可進行空間轉(zhuǎn)錄組實驗。因組織類型、時間和存放條件的不同，RNA的降解速度也會存在差異，因此僅依靠存放年限無法準確判斷石蠟包埋塊是否可用。目前是主要根據(jù)包埋塊切片RNA的 DV200>50%（最新CytAssist要求DV200>30%）指標來確定（不論樣本保存時間是否超過一年，都需要先進行質(zhì)檢）。

🔸 樣本規(guī)格要求，是否超過6.5*6.5mm即無法做空間轉(zhuǎn)錄組？

根據(jù)芯片規(guī)格推薦樣本大小在6.5*6.5mm之內(nèi)，但是如果組織樣本過大，對于新鮮樣本現(xiàn)階段可以提供兩種解決方案：1）選取整個組織中感興趣的區(qū)域（小于6.5*6.5mm），實驗人員評估修片可行性，然后決定是否進行后續(xù)實驗；2）若整個組織都為目標區(qū)域，則將組織分為兩份，分別貼片到兩個點陣進行后續(xù)實驗。

常規(guī)Visium芯片規(guī)格

此外，10x 公司新推出的CytAssist，提供了兩種芯片規(guī)格可供選擇，分別為6.5*6.5mm和11*11mm，較大組織也可實現(xiàn)一次性檢測，現(xiàn)在已經(jīng)可用于FFPE樣本實驗，并且后續(xù)升級后也可應用于新鮮樣本。

CytAssist芯片規(guī)格

新鮮/FFPE樣本質(zhì)檢要求

Part.02 常規(guī)Visium 與CytAssist相比做了哪些更新？

Q1: 實驗流程

🔸 常規(guī)Visium實驗流程：

樣本貼片于Visium芯片 ➡  脫蠟、HE染色、成像➡  探針雜交 ➡  建庫和測序

🔸 CytAssist實驗流程：

FFPE組織切片后貼于標準載玻片  ➡  脫蠟、染色、成像、解交聯(lián)、探針雜交 ➡  CytAssist儀器中完成分析物轉(zhuǎn)移 ➡  建庫和測序

🔸 流程更新：

常規(guī)Visium的脫蠟、HE染色、成像以及探針雜交等步驟在Visium空間芯片上進行；CytAssist的脫蠟、染色、成像、解交聯(lián)和探針雜交等步驟在標準載玻片進行，隨后在Visium CytAssist儀器中進行明場成像以及完成分析物轉(zhuǎn)移，無需進行多次切片貼片及粘附性測試實驗，極大的簡化了樣本的處理。

常規(guī)Visium vs CytAssist實驗流程對比

Q2: 其他

常規(guī)Visium vs CytAssist

Part.03 單細胞+空間聯(lián)合分析

Q1: 空間轉(zhuǎn)錄組是單細胞分辨率的嗎？

空間轉(zhuǎn)錄組的檢測不是單細胞層面的，Visium芯片一個玻片上每個捕獲區(qū)域面積為6.5mm*6.5mm（CytAssist提供了6.5mm*6.5mm和11mm*11mm兩個規(guī)格芯片），每個點陣內(nèi)有約5000個spot，根據(jù)樣本類型不同，每個spot內(nèi)的細胞數(shù)約1-10個細胞。Q2: 為什么要做空間轉(zhuǎn)錄組？

組織中除了細胞異質(zhì)性，其空間分布對于疾病的發(fā)生發(fā)展也有重要的意義。單細胞測序能夠鑒定組織中的細胞類型，但有時會發(fā)現(xiàn)對照組和處理組的細胞類型相似。以腫瘤為例，通過單細胞測序，可能在對照組和處理組都發(fā)現(xiàn)了相同的免疫細胞類型，而免疫細胞浸潤對疾病的發(fā)展和預后具有明顯的影響。因此，如果僅僅靠單細胞一個層面的數(shù)據(jù)，有時是很難解釋清楚，此時細胞類型在組織的空間分布對于數(shù)據(jù)分析就顯得尤為重要。通過結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組能夠?qū)⒉煌�細胞類型表達的marker基因映射到空間上，從而比較不同組織類型間細胞類型的空間分布特征。單細胞聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組分析不僅可以提高細胞類型注釋的可靠性，還可以精確全面地揭示表達譜信息，特定細胞類型及其特定空間位置、特定生物學過程中的信號傳導過程、細胞和細胞之間的通訊聯(lián)系（在空間上是否真實分布在臨近區(qū)域）。

此外，傳統(tǒng)的FISH和IF雖然可以觀察到病理組織的空間信息，但屬于中低通量的檢測，多用于篩選后的結(jié)果驗證。

Q3: 如何跟單細胞聯(lián)合分析？

（1）通過單細胞細胞類型鑒定結(jié)果輔助判定細胞的空間分布

通過分析單細胞數(shù)據(jù)，確定于疾病密切相關(guān)的細胞群，然后通過將單細胞注釋到的細胞群marker基因圖譜與空間數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，確定不同細胞類型的空間分布，為了解細胞類型的特定空間位置分布提供依據(jù)。

（2）對比不同分組間的空間結(jié)果，深入挖掘單細胞數(shù)據(jù)

🔸 分析不同細胞類型如何分布（在疾病區(qū)域、鄰區(qū)或正常區(qū)域），確定空間結(jié)構(gòu)是否具有明確區(qū)域劃分；

🔸 通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，不同區(qū)域之間是否有特異性的差異基因；

🔸 不同區(qū)域的細胞之間是否存在細胞互作關(guān)系，并聯(lián)合特異性的差異基因功能分析，探討細胞互作涉及的分子機制及通路，尋找疾病發(fā)病機制及治療靶點。

Q4: 空間轉(zhuǎn)錄組測序和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序一起進行聯(lián)合分析，是否每個空轉(zhuǎn)的樣本都需要搭配相同樣本的單細胞轉(zhuǎn)錄組？

如果空轉(zhuǎn)的樣本來自不同的患者，推薦每個患者各做一個單細胞測序。如果有幾個空轉(zhuǎn)的樣本來自一個患者的同一個組織，可以這幾個樣本做一個單細胞，具體還需要根據(jù)不同的實驗設計決定樣本量，但是有一個基本前提：單細胞和空間樣本在病理上出現(xiàn)的細胞類型是重合的。