與固相篩選相比，使用完整細(xì)胞作為篩選底物的最大優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞膜表面的受體保持天然構(gòu)象，受體蛋白無(wú)需純化，更有利于篩選功能性抗體。噬菌體抗體庫(kù)不僅可以通過(guò)與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行篩選，還可以通過(guò)內(nèi)化進(jìn)行篩選。由于配體-受體結(jié)合后，配體-受體復(fù)合物可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)化作用被吞入細(xì)胞，因此這種方法可用于篩選可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)化作用被內(nèi)化的噬菌體抗體�？贵w-抗原結(jié)合可以模擬這一過(guò)程，因此這種方法可用于篩選可被細(xì)胞內(nèi)化的抗體。

 

一．細(xì)胞篩選原理

 

細(xì)胞表面分布著大量的信號(hào)分子，它們反映了細(xì)胞的特性以及所處的功能狀態(tài)。雖然可以將分子直接作為篩選標(biāo)靶，但對(duì)于純化困難或表達(dá)量少的受體等分子，它們需要完整的細(xì)胞膜，或者與細(xì)胞膜上的其他亞單位形成復(fù)合物才能發(fā)揮作用。

 

二．全細(xì)胞篩選的優(yōu)缺點(diǎn)

  

 

優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
1、不需要對(duì)受體分子進(jìn)行純化，也不需要分析受體結(jié)構(gòu)，且受體處于天然構(gòu)想狀態(tài)，能保證其真實(shí)的結(jié)合活性； 2、不需要預(yù)先確定具體的目的受體，可以尋找細(xì)胞表面未知受體及其配體分子； 3、還能夠篩選到內(nèi)在化的受體，用于某些疾病靶向藥物的開(kāi)發(fā)； 4、可與細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，直接篩選到對(duì)某種細(xì)胞膜分子的功能及細(xì)胞表型有影響的活性肽。	1、細(xì)胞膜表面具有大量的生物活性大分子，其多樣性和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多變性使非特異性結(jié)合占有很高的比例； 2、反復(fù)數(shù)輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”會(huì)使細(xì)胞與特異性結(jié)合配體的損失嚴(yán)重； 3、有些蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量很少，當(dāng)表達(dá)量低于文庫(kù)中任何一個(gè)多肽的親和力常數(shù)時(shí)，就很難得到預(yù)期的效果； 4、細(xì)胞膜上的其他蛋白或糖基造成的空間結(jié)構(gòu)可影響對(duì)目的多肽的結(jié)合。

 

三．全細(xì)胞篩選策略

   

 

	篩選已知細(xì)胞表面受體	篩選未知細(xì)胞表面受體
基本思路	在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)抗體庫(kù)中不含目標(biāo)受體的空白細(xì)胞，去除非目標(biāo)抗體（即陰性篩選），然后用未吸附的噬菌體與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，獲得與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的抗體（即陽(yáng)性篩選），經(jīng)過(guò)幾輪“陰性篩選-陽(yáng)性篩選-擴(kuò)增”，就能富集出特異性抗體。	篩選細(xì)胞表面的未知受體往往會(huì)得到針對(duì)細(xì)胞表面大量分子受體的抗體，因此必須避免抗體與正常組織之間的交叉反應(yīng)。有必要選擇合適的陰性細(xì)胞來(lái)篩查背景，提高信噪比。
缺點(diǎn)	在陰性選擇過(guò)程中，非特異性噬菌體不能被有效屏蔽，在陽(yáng)性篩選過(guò)程中，一些拷貝數(shù)小的陽(yáng)性克隆容易丟失，富集的抗體克隆大多是非特異性的，在數(shù)量和多樣性上都遠(yuǎn)不如純抗原。	在受體抗原性質(zhì)不確定、功能受體表達(dá)稀缺的復(fù)雜抗原環(huán)境中，篩選往往會(huì)受到受體偏差和多樣性的干擾，使篩選效率低下，產(chǎn)生較高的篩選背景。此外，該技術(shù)操作難度大，回收的噬菌體少，抗體親和力低，開(kāi)發(fā)價(jià)值不大。

 

四．細(xì)胞篩選的實(shí)驗(yàn)流程

 

(1) 細(xì)胞處理：篩選用細(xì)胞中加入EDTA，4℃、1000rpm離心10min；

(2) 洗滌：處理好的細(xì)胞用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基4℃、2000rpm離心1min，洗滌1-2次；

(3) 孵育噬菌體：取提前制備的噬菌體溶液加入至篩選細(xì)胞中，加入DMEM培養(yǎng)基，4℃孵育2h；

(4) 洗滌：孵育好的細(xì)胞用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基4℃、3000rpm離心1min，洗滌8-10次，再用PBST洗滌3次；

(5) 洗脫：4℃、3000rpm離心5min離心，棄去上清，加入Tris-HCl(pH=3.0)，重懸細(xì)胞，4℃、4000r離心5min，迅速用Tris-HCl(pH=8.0)中和至約pH=7.0。

(6) 活化2738：取兩支離心管，倒入LB 液休培養(yǎng)基，加入四環(huán)不素，其中一支加入從2738平板上挑一個(gè)單個(gè)菌落，另一支做空白對(duì)照，37℃，250r的搖床內(nèi)培養(yǎng)4h。

(7) 洗脫產(chǎn)物稀釋：取3支無(wú)菌的1.5ml離心管，分別加入無(wú)菌的LB培養(yǎng)基，向第一管內(nèi)加入脫產(chǎn)物，混勻，從第一支內(nèi)取出加入第二支管內(nèi)，混勻，再?gòu)牡诙�管取出加入第三管�?nèi)，混勻。

(8) 侵染：取3支無(wú)菌的離心管，分別加入活化好的2738菌液，及稀釋的洗脫產(chǎn)物（一個(gè)梯度一支管），在37°C放置1.5h。

(9) 倒板：向侵染的菌液加入3-4ml 己加過(guò)IPTG及x-gal的上層膠，混勻，倒在IPTG+X-gal的平板上（平板需先在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱至少1h），放在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜。

 

五．當(dāng)前比較成功的細(xì)胞篩選方法主要有：

 

(1) 差減篩選：應(yīng)用該方法從噬菌體抗體庫(kù)中篩選靶向黑色素瘤細(xì)胞的抗體。舉例具體操作：先用黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行幾輪陽(yáng)性篩查，然后用正常黑色素瘤進(jìn)行陰性篩查，以扣除不與陽(yáng)性細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體。由于細(xì)胞表面抗原濃度低，加上演繹篩選的固有缺陷，這種篩選方法非常困難。

(2) 細(xì)胞內(nèi)化篩選：某些抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，抗原-抗體復(fù)合物可以被吞噬到細(xì)胞中，因此可以使用細(xì)胞內(nèi)化篩選方法來(lái)篩選此類抗體。有研究證明，這種篩選方法是可行的，而且比細(xì)胞表面篩選更容易獲得特異性噬菌體抗體。

 

六．全細(xì)胞篩選法的應(yīng)用

 

全細(xì)胞篩選法可應(yīng)用于尋找新的受體、配體及抗原表位分析，新型肽苗的開(kāi)發(fā)，基因治療靶向載體的篩選，腫瘤靶向治療載體的篩選，酶受體激動(dòng)劑和拮抗劑的開(kāi)發(fā)，疾病的檢測(cè)及治療等多個(gè)方面。

 

我們在文庫(kù)構(gòu)建方面具有成熟穩(wěn)定的技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)提供1級(jí)免疫文庫(kù)的建庫(kù)庫(kù)容為10⁸-10⁹，插入率均滿足>95%，篩選獲得的抗體親和力普遍處于nM-pM級(jí)別。具備多種篩選體系，包括直接篩選法、競(jìng)爭(zhēng)法、負(fù)篩選法、細(xì)胞篩選法等，可提供VHH篩選、scFv序列篩選、Fab抗體篩選等，滿足不同客戶的不同需求。產(chǎn)品交付標(biāo)準(zhǔn)高：針對(duì)免疫庫(kù)，交付免疫前后血清，抗體展示文庫(kù)，篩選洗脫產(chǎn)物，CDR區(qū)域補(bǔ)充度的納米抗體序列，QC質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（含RNA提取，cDNA制備等）。