1.什么是雜交瘤測序
雜交瘤細胞抗體基因測序是指使用專業(yè)的兼并引物設(shè)計(degenerate primer)和測序方案,同時優(yōu)化經(jīng)濟成本和時間成本,為客戶提供快速準(zhǔn)確的抗體可變區(qū)域以及全長基因測序服務(wù)。
圖1:雜交瘤測序
2.雜交瘤測序目的
雜交瘤細胞在保存過程中存在抗體基因丟失、細胞狀態(tài)不好影響抗體產(chǎn)生,甚至細胞死亡的情況,為將優(yōu)秀抗體長期保存、穩(wěn)定生產(chǎn),可將雜交瘤細胞中的抗體基因提取并測序,最終拿到核苷酸序列,并以 DNA 形式保存,用于后期外源表達及生產(chǎn)。雜交瘤細胞抗體測序所獲取的雜交瘤細胞單克隆抗體基因序列,是發(fā)表文章或?qū)@仨毿畔⒑椭亟M表達工程抗體的前提之一,同時也是抗體人源化工作的基礎(chǔ)。
4.我們能夠為客戶提供高質(zhì)量的雜交瘤測序服務(wù)
標(biāo)準(zhǔn)周期單克隆抗體測序服務(wù):抗體可變區(qū)VH和VL測序、抗體VH,VL和前導(dǎo)區(qū)測序、全抗體VH,VL,前導(dǎo)區(qū)和恒定區(qū)測序,3-4周完成測序服務(wù)。
快速單克隆抗體測序服務(wù):從目標(biāo)細胞株快速識別的抗體序列,可在10天內(nèi)獲得測序結(jié)果。
5.為客戶提供雜交瘤測序服務(wù)的全流程介紹
雜交瘤測序服務(wù),流程包括:RNA提取,cDNA克隆,T載體構(gòu)建,抗體基因測序,生物信息學(xué)分析,項目報告。
圖2:雜交瘤測序流程
5.1雜交瘤生產(chǎn)和總RNA提取5.2.1反轉(zhuǎn)錄
使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒,另外使用的是RNA樣本(來自小鼠抗體的雜交瘤RNA樣本或來自嵌合抗體RNA樣本)、引物、10 mM脫氧核苷酸三磷酸混合物(dNTPs)、H2O和80U/μLRNAse抑制劑。注意:由于其RNA含量,將模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸分裝并儲存在–80℃。
根據(jù)以下方案執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄:在操作期間將所有反應(yīng)保持在冰上。對于每個RNA樣品,設(shè)置三個cDNA合成反應(yīng):一個用于kappa鏈,一個用于lambda鏈,一個用于重鏈。理想情況下,每個抗體只會擴增一條輕鏈。
圖3:3H4 kappa 和 3H4 lambda 可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列比較
5.2.1.1 在PCR管中,準(zhǔn)備Mix 1:2μL 50ng/μL RNA、1μL 10μM基于抗體鏈的反向RT引物(例如用于小鼠抗體的mIGKRT、mIGLRT或mIGHGRT)和1μL 10mM dNTP。對于一個RNA樣本,需要三管Mix1,每管包含不同的反向引物。
5.2.1.2 在0.5mL Eppendorf管中,配制Mix 2:1.95μL H2O、2μL 5x SMARTScribe緩沖液、1μL 20mM DTT和0.3μL 100μM模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸。為Mix2提供的體積用于一個cDNA合成反應(yīng),因此根據(jù)需要進行放大,即每個雜交瘤RNA樣品制備Mix 2體積的三倍。為所有反應(yīng)準(zhǔn)備了Mix 2的一種主混合物。
5.2.1.3 通過在熱循環(huán)儀中將含有Mix 1的試管在72℃下孵育3分鐘,使RNA二級結(jié)構(gòu)變性。
5.2.1.4在Mix 1變性期間,將以下物質(zhì)添加到Mix 2:每個cDNA合成反應(yīng)0.25μL 80U/μL RNAse抑制劑和0.5μL 100U/μL SMARTScribe逆轉(zhuǎn)錄酶。
5.2.1.5 將6μL Mix 2添加到每管變性Mix 1中。
5.2.1.6在熱循環(huán)儀中,合并的混合物在42℃下孵育60分鐘,然后在70℃下孵育5分鐘終止反應(yīng)。反應(yīng)保持在4℃。逆轉(zhuǎn)錄后立即進行PCR擴增。不需要cDNA純化步驟。
5.2.2 抗體可變區(qū)的PCR擴增5.2.2.1為每個cDNA合成設(shè)置PCR反應(yīng):10μL 5x PCR緩沖液,1μL 10mM dNTPs,3μL RT反應(yīng)合成的cDNA,2.5μL 10μM通用正向引物ISPCR,2.5μL 10μM反向PCR引物在抗體鏈上(例如小鼠抗體的mIGKPCR、mIGLPCR或mIGHGPCR)、30.5μL H2O和0.5μL 2U/μL Phusion聚合酶(或其他高保真聚合酶)。
5.2.2.2根據(jù)以下熱循環(huán)儀條件進行降壓/降壓PCR:98℃ 30秒;98℃ 15秒、63–57.5℃ 30秒(每個循環(huán)降低溫度0.5℃)和72℃ 30秒的10個循環(huán);98℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒15個循環(huán);隨后72℃ 7分鐘;并保持在4℃。
5.2.2.3每個RT-PCR反應(yīng)取5μL在90V的TAE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上運行。擴增的小鼠抗體產(chǎn)物出現(xiàn)在550-600個堿基對之間。擴增的人抗體產(chǎn)物出現(xiàn)在750-850個堿基對之間。Quick Load Purple 2-Log DNA Ladder(NEB,N0550S)用作標(biāo)準(zhǔn)品。
圖4:抗體可變區(qū)PCR擴增
5.3 T載體構(gòu)建
使用Macherey-Nagel的PCR清理和凝膠提取試劑盒對RT-PCR反應(yīng)進行PCR清理。根據(jù)平末端克隆試劑盒手冊,將2μL的每個PCR清洗的產(chǎn)物平末端克隆到pCR-Blunt-II-TOPO載體中。接下來,將每個TOPO克隆反應(yīng)的3μL轉(zhuǎn)化為化學(xué)感受態(tài)E.Coli。將每個轉(zhuǎn)化的100μL涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上,并在37℃下孵育過夜。
5.4 抗體基因測序
獲得菌落后,將每條抗體鏈5-10個菌落接種在5mL LB/卡那霉素培養(yǎng)基中,并在37℃下以250rpm搖動過夜。這些培養(yǎng)物使用Macherey-Nagel的小量制備試劑盒進行小量制備,所得質(zhì)粒DNA由Sequetech Corporation使用M13正向引物進行Sanger測序。
5.5生物信息學(xué)分析
使用 GitHub 上提供的自定義 Python 程序分析測序數(shù)據(jù),去除非功能性的DNA。
5.6項目報告
交付得到的抗體序列。