最近，總有小伙伴們前來詢問在做完電轉(zhuǎn)實驗后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率太低了該怎么辦，于是小優(yōu)通過搜集多方資料、詢問技術(shù)專家，為大家找來了一些解決方案，下面我們就來一起看看吧～

 

一、什么是電轉(zhuǎn)？

俗話說得好，知己知彼，方能百戰(zhàn)百勝，所以首先我們需要清楚電轉(zhuǎn)的原理。電轉(zhuǎn)，也稱電穿孔法，是通過脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔，將外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，來改變細(xì)胞的特性，從而達(dá)到改造細(xì)胞的目的，是實現(xiàn)細(xì)胞基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)研究的重要工具。與其他細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)相比，電轉(zhuǎn)具有操作簡便、適用多種細(xì)胞、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點。

 

二、影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些呢？

影響電轉(zhuǎn)效率的因素有很多，總結(jié)下來有三方面：電轉(zhuǎn)過程、細(xì)胞狀態(tài)以及轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)。只有了解影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些，我們才能夠“對癥下藥”。

 

1.電轉(zhuǎn)過程

1）電轉(zhuǎn)的完整操作步驟包括電轉(zhuǎn)前操作，電轉(zhuǎn)執(zhí)行和電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)前操作時，電轉(zhuǎn)試劑、細(xì)胞與轉(zhuǎn)染底物要進(jìn)行混勻，如果混勻時過于激烈，會破壞轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低；

2）在進(jìn)行電轉(zhuǎn)前操作時，電擊緩沖液的選擇也很重要，由于細(xì)胞對緩沖液的離子組成和滲透壓非常敏感，因此組分與細(xì)胞質(zhì)類似的緩沖液有利于細(xì)胞電擊后的存活；

3）電轉(zhuǎn)執(zhí)行時，需要控制電場強度和脈沖時間。適當(dāng)提高電場強度或延長脈沖時間，能使底物更容易進(jìn)入細(xì)胞，但細(xì)胞的死亡率也會增加。一般電場強度設(shè)置遵循低電場長時程的原則。如果選擇內(nèi)置優(yōu)化程序的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，如Lonza的Nucleofector系統(tǒng)，則可以節(jié)省摸索電場強度和脈沖時間的步驟。

4）轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，這是因為轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有損傷，這時培養(yǎng)基中的抗生素會進(jìn)一步損傷細(xì)胞，因此我們建議使用不含抗生素的培養(yǎng)基或PBS；

5）電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)要注意，如果使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后4-6h后必須進(jìn)行換液，否則會由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引起細(xì)胞死亡，最終影響轉(zhuǎn)染效率。

 

2.細(xì)胞狀態(tài)

1）細(xì)胞污染對細(xì)胞狀態(tài)的影響很大，受到細(xì)菌、真菌或支原體污染的細(xì)胞都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低、細(xì)胞死亡率增加，尤其是支原體污染悄無聲息，因此一定要做好定期的支原體檢測，確保細(xì)胞狀態(tài)；

2）細(xì)胞培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉(zhuǎn)，但最好的轉(zhuǎn)化效率是在細(xì)胞的對數(shù)生長期（15代以內(nèi)，傳代后2d）。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，有絲分裂較旺盛，表面結(jié)構(gòu)密度比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA。

 

3.轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)

1）不同的轉(zhuǎn)染底物對轉(zhuǎn)染效率都會產(chǎn)生不同的影響，例如質(zhì)粒DNA在大小、用量以及構(gòu)象這三方面都影響著電轉(zhuǎn)效率，IRES導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染mRNA需要調(diào)整洗滌次數(shù)等等；

2）轉(zhuǎn)染試劑與底物的配比，也會影響轉(zhuǎn)染效率，因此需要根據(jù)說明書或參考文獻(xiàn)來進(jìn)行配比優(yōu)化實驗，選用最佳配比濃度；

3）底物的內(nèi)毒素，也會影響轉(zhuǎn)染效率，內(nèi)毒素含量過高，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞狀態(tài)變差，從而增加細(xì)胞死亡率，降低轉(zhuǎn)染效率，因此要對內(nèi)毒素進(jìn)行控制。

 

三、如何提高電轉(zhuǎn)效率？

我們都知道，電轉(zhuǎn)的操作是需要借助儀器來完成的，因此除了要考慮上面的這些因素外，更重要的是選擇一個高效的電轉(zhuǎn)儀。

 

注：圖片來自Lonza官網(wǎng)

 

提高電轉(zhuǎn)效率的方法

 

1.細(xì)胞收集時：

1)在消化貼壁細(xì)胞時，一定要注意終止胰酶反應(yīng)，防止過度消化；最好使用專業(yè)的胰酶中和劑；

2)在進(jìn)行細(xì)胞離心時，使用低轉(zhuǎn)速長時間離心，提升細(xì)胞的存活率；

3)選擇合適狀態(tài)的細(xì)胞，一般原代細(xì)胞可以傳1-2次后使用；盡量挑選迭代次數(shù)少的細(xì)胞，如果是凍存細(xì)胞，建議復(fù)蘇1-2h后使用；

4)選擇對數(shù)增長期的細(xì)胞；

5)做好支原體清除。

 

2.試劑添加：

1）電轉(zhuǎn)試劑的添加只需室溫操作即可；

2）細(xì)胞在試劑中停留不超20min，混合好盡快開始實驗；

3）轉(zhuǎn)染的底物占比不能大于總體積的10%，比如轉(zhuǎn)染體系100ul，底物最多添加10ul；

4）在消化的細(xì)胞進(jìn)行配置時，一定要離心并完全去除殘留培養(yǎng)基；

5）在加入到電極杯中時，要避免產(chǎn)生氣泡，從而影響電脈沖；

6）對底物進(jìn)行內(nèi)毒素控制；

7）轉(zhuǎn)染試劑與底物濃度配比控制；

8）如果是mRNA轉(zhuǎn)染，可多洗滌2次。

 

3.程序設(shè)置：

1）使用電轉(zhuǎn)儀，程序已經(jīng)設(shè)定好，可以根據(jù)不同的細(xì)胞名稱，選擇對應(yīng)的最優(yōu)程序； 根據(jù)實際情況，可以對程序進(jìn)行微調(diào)，確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。

2）使用需要自行設(shè)置的儀器，一般電場強度設(shè)置遵循低電場、長時程的原則。

 

4.細(xì)胞重懸：

1）轉(zhuǎn)染結(jié)束之后，可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸；

2）使用無鈣培養(yǎng)基重懸，5-10min后轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)皿上；

3）后續(xù)的實驗一般在轉(zhuǎn)染后24h再進(jìn)行；

4）電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞，鋪板數(shù)量翻一倍。

 

5.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的培養(yǎng)：選擇表達(dá)高峰期細(xì)胞做實驗。