Tamar Sapir1, Aditya Kshirsagar 1, Anna Gorelik1, Tsviya Olender1, Ziv Porat 2, Ingrid E. Scheffer 3,David B. Goldstein4, Orrin Devinsky 5 & Orly Reiner
 

細胞死亡包括細胞程序性死亡（主動死亡）、細胞凋亡和細胞壞死（被動死亡），可由多種機制引起，其中Tp53通路起著關鍵作用。細胞死亡介導途徑的調控發(fā)生在多個階段，包括轉錄、轉錄后和翻譯后的水平。RNA剪接是一種轉錄后事件，根據特定的細胞環(huán)境允許包含或排除基因序列。剪接體介導RNA剪接，這是一種包含RNA(如小核核糖核蛋白和異質核核糖核蛋白(HNRNPs))和其他蛋白質的復合體。而一種介導核染色質形成的剪接體異質核核糖核蛋白HNRNPU編碼異質核核糖核蛋白U在哺乳動物的發(fā)育過程中起著至關重要的作用。

HNRNPU的微缺失或點突變都會導致一系列疾病，包括早發(fā)性癲癇和嚴重的智力障礙、低外顯性小頭畸形、胼胝體薄、面部畸形和張力減退。然而，對于發(fā)育中的大腦中HNRNPU的功能還缺乏了解。近日，以色列-雷霍沃特魏茲曼科學研究所、墨爾本大學聯合紐約-哥倫比亞大學基因組醫(yī)學研究所，三家研究團隊在國際知名科學期刊Nature Communications上發(fā)表了題為“Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (HNRNPU) safeguards the developing mouse cortex”的文章，目的是了解HNRNPU在大腦發(fā)育中的作用。結果顯示HNRNPU功能的喪失導致有絲分裂后神經元和神經祖細胞的快速死亡，后者的敏感性明顯更高。此外，參與細胞存活、細胞運動和突觸形成的多個基因的表達和選擇性剪接在Hnrnpu條件突變后受到影響，降低剪接因子SRSF3的水平可以抑制HNRNPU功能效應的喪失，并改善神經祖細胞的生存能力和神經元遷移。最后研究人員并確定了可以部分逆轉Hnrnpu突變胚胎大腦皮層結構的丟失、改善徑向神經遷移缺陷和挽救培養(yǎng)的神經祖細胞死亡的遺傳藥物試劑。
 

為了研究HNRNPU在大腦發(fā)育中的作用，使用含條件HNRNPU等位基因的小鼠與Emx1^Cre小鼠雜交。結果顯示發(fā)育中小鼠的大腦表達豐富HNRNPU水平，最顯著的是在腦室區(qū)(VZ)的頂端和皮質板(圖1A-C’)，使用ImageStream流式細胞儀分析游離神經球中的HNRNPU(圖1D、E)表明蛋白質的表達是動態(tài)的，雖然有絲分裂細胞表達高水平的HNRNPU，但蛋白質不附著在染色質上。相反，G1/S期細胞的HNRNPU信號強度降低，更好的與染色質共定位。Emx1^Cre表達和Hnrnpu突變的大腦區(qū)域逐漸被忽略，而E18皮質更小，P8大腦缺乏端腦(圖1F-I)。在E18，皮質的內側區(qū)域消失了，但皮質的殘余在外側仍然可見(G, M)。這些區(qū)域表達Tbr1，但其在更深的皮層典型定位丟失了(圖1K, N)。在突變體皮質中可以檢測到膠質纖維酸性蛋白然而，膠質纖維酸性蛋白（GFAP）在皮質板上的表達減少了約40%(圖1L, O, P)。經過21天，突變小鼠存活了下來，但體積變小了且所有皮質結構都基本喪失。(圖1T, V)，然而，該區(qū)域表達神經元和膠質標志物的混合物(圖1Q-V)。
 

圖1:HNRNPU在小鼠有絲分裂神經祖細胞中強烈表達，對大腦發(fā)育至關重要

作者使用延時顯微鏡觀察了電轉染后體外培養(yǎng)的皮層細胞的存活情況(圖2A-M)，以更好地了解突變大腦中觀察到的表型(Emx1^cre/+ Hnrnpu ^fl/fl)。培養(yǎng)的細胞成像3小時(圖2A-M)，在體外兩天的修復(圖2N-V)。Hnrnpu ^fl/fl胚胎大腦用雙色Cre報告蛋白CAG::spotlight (CAG::SL)進行電轉染，并結合無Cre、構成Cre (CAG:: NLS-Cre- GFP)、中間祖細胞Cre (Tbr2:: Cre)或有絲分裂后神經元Cre (Ta1::Cre)。CAG聚光組成性表達了一種綠色熒光蛋白，該蛋白在Cre活性被切除后，允許一種紅色熒光蛋白表達。在成像期間，對照細胞中未觀察到細胞死亡(圖2A-C, M)。當使用Ta1啟動子時，可以看到表達切除的Cre報告基因的活細胞比例更高(圖2V)
 

圖2:神經祖細胞對HNRNPU丟失高度敏感
 

作者從E13 Hnrnpu^fl/fl Emx1^Cre/₊ (Homo)、Hnrnpu^fl/+ Emx1^Cre/+ (Het)胚胎和對照胎鼠(WT)的皮層中生成RNA-seq文庫(圖3)。通過轉錄組學分析，以深入了解所觀察到的Hnrnpu缺失病理的分子機制，結果表明，HNRNPU強烈影響基因表達。
 

圖3：Hnrnpu突變體皮層顯示了對大腦發(fā)育和功能至關重要的基因的mRNA表達和選擇性剪接的變化
 

由于Hnrnpu的突變會導致細胞死亡，為了驗證這一表型，研究人員將小鼠皮層胚胎神經祖細胞作為原代神經球培養(yǎng)，使用NEPA21電轉儀將CRISPR/Cas9 Hnrnpu gRNA轉染到培養(yǎng)的神經球中，據細胞計數估計，40%的分離細胞為GFP陽性，活細胞高達90%，并使用10× Genomics^©平臺進行單細胞RNA-seq實驗。結果顯示低Hnrnpu表達的細胞TP53通路活性增加，而在同一培養(yǎng)物中具有高Hnrnpu表達的細胞，該通路被抑制。為了進一步驗證這一發(fā)現，我們追蹤了接受相同培養(yǎng)條件的神經球以及突變腦切片中TP53的動態(tài)穩(wěn)定性(圖4A-F)。通過Ingenuity分析確定的TP53調控的272個基因中的幾個關鍵基因(圖4G)并追蹤了轉染Hnrnpu sgRNA的神經球的功能顯示了大多數已驗證的與該通路相關的基因之間可能的網絡連接示意圖（圖4H-I’）

（略）
圖4 :Hnrnpu KO.后TP53介導的細胞凋亡途徑被激活
 

研究人員還研究了減少神經圈培養(yǎng)中觀察到的細胞死亡的遺傳學方法。除了通過CRISPR介導的Tp53缺失或通過含有Mdm2的外顯子3的異位表達來操縱P53水平外，作者還檢測了CRISPR-介導的Srsf3缺失(圖5B-D)。在缺乏HNRNPU的情況下，SRSF3蛋白水平降低，Mdm2外顯子3包合物的比例恢復到野生型水平，通過觀察電轉染后的神經球圖像（圖5A）發(fā)現神經球的大小進行了恢復。此外，Hnrnpu的缺失影響了與細胞遷移和運動以及細胞骨架有關的基因，這些基因都對正常的神經元遷移至關重要(圖3B)。研究人員并在小鼠子宮內電轉染法檢測了Hnrnpu缺失對神經元遷移的影響,小鼠妊娠14天后進行麻醉，暴露子宮口，用口吸管通過子宮，通過拉動的玻璃毛細血管將與Fast Green（2μg/μl；Sigma）混合的質粒微量注射到胚胎的側腦室。通過NepaGene公司電轉儀器NEPA21產生的5個脈沖放電程序來完成電轉染，脈沖通過位于每個胚胎頭部兩側的直徑為10毫米的鍍鉑鑷子電極通過子宮傳遞。結果發(fā)現在子宮內植入Hnrnpu sgRNA可有效降低Hnrnpu蛋白水平，RNA剪接的調節(jié)可以逆轉由HNRNPU功能喪失導致細胞活力的受損和神經元遷移。

（略）

圖5：Srsf3下調補償了HNRNPU的活性損失
 

最后，研究人員通過重點研究TP53通路在體外培養(yǎng)祖細胞死亡和皮層結構完全丟失中的作用，HNRNPU和SRSF3的減少會影響多個基因的表達和剪接導致了TP53上游調控因子的改變，從而激活該通路導致細胞壞死。應用不同的細胞死亡抑制劑(例如Caspase, TP53壞死抑制劑)挽救了神經球的生長，增加祖細胞增殖，并部分恢復層標記物的表達使得大腦皮層表現出了更完善的組織結構，并顯著改善了中心體同化。總之，數據表明HNRNPU調節(jié)剪接，對大腦的發(fā)育至關重要。

在本研究中，作者使用了免疫組學、轉錄組學、神經球制備及電轉染、子宮內電轉染、成像流式細胞術、構建MARS-seq文庫和單細胞RNA-seq等方法才使得實驗順利完成。

NEPAGENE公司是全球知名的電轉染和電融合等設備研發(fā)及生產廠家，本實驗中，研究人員借助NEPA21卓越的基因導入功能完成了CRISPR/Cas9 Hnrnpu gRNA導入到小鼠皮質層培養(yǎng)的神經球以及子宮內發(fā)育中的胚胎大腦中，從而驗證了Hnrnpu的突變會導致細胞死亡的這一表型，同時細胞計數表明轉染效果好，細胞的存活率高。

本文采用的是NEPA GENE品牌的NEPA21基因高效轉染系統(tǒng)，采用全新設計的電轉程序，電壓衰減（Voltage Decay）模式；基因導入+反向導入模式。不需要特殊轉染試劑輔助，節(jié)省實驗成本；電轉程序中的各項參數實時可見、可調，特別適用于優(yōu)化原代細胞、非常見細胞的電轉參數。
 

NEPA21專利的電壓衰減（Voltage Decay）設計，可在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。專門針對難轉染的原代免疫細胞、干細胞、神經細胞、活體動物、受精卵以及宮內胚胎等轉染。目前已有多篇應用文獻。

 

論文鏈接

https://doi.org/10.1038/s41467-022-31752-z

參考文獻

1、Sapir, T., Kshirsagar, A., Gorelik, A. et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (HNRNPU) safeguards the developing mouse cortex. Nat Commun 13, 4209 (2022).

2、Aylon, Y. & Oren, M. The paradox of p53: what, how, and why? Cold Spring Harb. Perspect. Med. 6, 1–15 (2016).

3、Wong, F. K. & Marin, O. Developmental cell death in the cerebral cortex. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 35, 523–542 (2019).

4、Phan, T. P. et al. Centrosome defects cause microcephaly by activating the 53BP1-USP28-TP53 mitotic surveillance pathway. EMBO J. 40, e106118 (2021).

5、 Poot, M. HNRNPU: key to neurodevelopmental disorders such as intellectual delay, epilepsy, and autism. Mol. Syndromol. 9, 275–278 (2019).

6、百度百科（baidu.com）

 

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