免疫細(xì)胞

免疫細(xì)胞包括很多細(xì)胞：

先天免疫細(xì)胞：粒細(xì)胞（嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞），肥大細(xì)胞，單核細(xì)胞（發(fā)展成巨噬細(xì)胞），中性粒細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞（DC是一種重要的抗原呈遞細(xì)胞（APC），也可以由單核細(xì)胞發(fā)育而來(lái)），自然殺傷細(xì)胞(NK具有先天免疫和適應(yīng)性免疫的雙重特性，可以保留為記憶細(xì)胞）。

適應(yīng)性免疫細(xì)胞：B細(xì)胞（有兩個(gè)主要功能: ① 向T細(xì)胞提供抗原，② 產(chǎn)生抗體來(lái)中和感染性微生物。）T細(xì)胞（有多種作用，并按亞群分類(lèi)。T細(xì)胞分為兩大類(lèi): CD8+ T細(xì)胞或CD4+ T細(xì)胞）。

免疫細(xì)胞的收集

免疫細(xì)胞的收集通常說(shuō)的是外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）的收集。正如名字所指出的，PBMC是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞（Lymphocytes）、單核細(xì)胞（Monocytes）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和其他少量細(xì)胞。

淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞，占據(jù)PBMC細(xì)胞的大多數(shù)，也并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)很多將兩者分開(kāi)的文章和操作手冊(cè)，因此在此我們只針對(duì)PBMC細(xì)胞的收集做一個(gè)概述。

PBMC存在于外周血中，可利用細(xì)胞分離技術(shù)從全血中分離出來(lái)�？偟膩�(lái)說(shuō)，PBMC只占全血樣本的一小部分（約1%），當(dāng)被其他物質(zhì)擠在一起時(shí)，很難進(jìn)行研究。三種最常見(jiàn)的PBMC分離方法包括：密度梯度離心、熒光活化細(xì)胞分選（FACS）、磁激活細(xì)胞分選(MACS)，每一種血液分離方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

密度梯度離心

密度梯度離心依靠物理特性，如大小和密度來(lái)分選細(xì)胞群。通過(guò)將樣品放入高速旋轉(zhuǎn)的離心機(jī)中，不同類(lèi)型的細(xì)胞將通過(guò)與相似密度的顆粒分組來(lái)進(jìn)行分類(lèi)。密度較大的粒子會(huì)落到底部或外面，而密度較小的粒子會(huì)停留在中心或上升到頂部。對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的全血樣本進(jìn)行離心，將分離出血液成分的一般層，集中在試管底部的紅細(xì)胞(大約占總體積的45%)，中間層的灰白色涂層層——包含各種白細(xì)胞和血小板(大約占總體積的1%)，以及血漿——包含允許血液流動(dòng)的水狀液體，隨著各種蛋白質(zhì)和溶解的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體(大約占總體積的55%)在管的頂部。

根據(jù)所用采血管含有的成分，密度梯度離心也有三種方法。

 

• 檸檬酸鈉CPT管采血的細(xì)胞分離

 

檸檬酸鈉是一種抗凝劑：檸檬酸根可與血液中的鈣離子結(jié)合，生成可溶解性的絡(luò)合物。由于鈣離子在凝血過(guò)程中起到促進(jìn)凝血作用，因此血液中的鈣離子濃度下降會(huì)阻止血液的凝結(jié)。

 

步驟：

1. 室溫(15℃~ 30℃)豎直存放血漿收集管，直到離心。

2. 離心前將試管輕輕倒轉(zhuǎn)8 - 10次，使細(xì)胞重新混合。

3. 將離心管置于水平轉(zhuǎn)子中，室溫(15℃~30℃)，1800 x g (RCF)離心30分鐘。轉(zhuǎn)速必須仔細(xì)計(jì)算。降速過(guò)程中不要使用剎車(chē)。應(yīng)注意確保CPT管是正確地安裝在離心機(jī)中。

4. 在離心機(jī)完全停止后，小心地取出試管并放置在一個(gè)架子上。

5. 單個(gè)核細(xì)胞和血小板位于血漿層下方的白色層中(見(jiàn)圖1)。

6. 在不干擾細(xì)胞層的情況下，從每根CPT管中抽取血漿層。如果方案要求收集血漿，請(qǐng)參閱方案的具體文件。

7. 用移液管從每個(gè)試管中收集單個(gè)核細(xì)胞層，并將其轉(zhuǎn)移到50mL帶帽的塑料錐形離心管。

8. 如果收集3根或更少(≤3根)CPT管，將全部CPT管收集到的細(xì)胞層放入一個(gè)50mL離心管。

9. 如果收集的CPT管多于3根(>3)，則取其中2 - 3根CPT管的細(xì)胞層放入一個(gè)50mL離心管。不要將三個(gè)以上CPT管的細(xì)胞層組合在一起放入一個(gè)50mL離心管。重復(fù)此步驟，直到將所有CPT管的細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，然后進(jìn)行洗滌步驟。

 

 

圖1 CPT管離心結(jié)果

 

• 帶有預(yù)填充 Frit 屏障的ACD、NaHep或EDTA管采集血液的細(xì)胞分離

 

在加入血液之前，目視檢查CSTFB，看是否有液體在 Frit上面。如果 Frit上面有液體，將CSTFB在1000 x g下離心30秒。如果有密度梯度離心后溶液仍在 Frit上方，應(yīng)吸除。

步驟：

1. 血液稀釋用于CSTFB分離

血液與生理鹽水的最大比例約為2:1。每10 ~ 20mL全血使用一個(gè)50mL管(或每5 ~ 10mL全血用一個(gè)12 ~ 14mL管)。按要求使用盡可能多的CSTFB來(lái)分配每個(gè)樣品的所有血液。

(1) 在每個(gè)CSTFB上標(biāo)上樣品識(shí)別號(hào)。

(2) 用無(wú)菌吸管向每個(gè)CSTFB中加入生理鹽水溶液：50mL CSTFB管加5mL生理鹽水。

(3) 輕輕混合全血，然后用無(wú)菌移液器將血液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的CSTFB中。

(4) 使用無(wú)菌移液器，用生理鹽水沖洗每個(gè)原始抗凝血管并轉(zhuǎn)移溶液沖洗量到CSTFB，確保不超過(guò)總管體積(生理鹽水+全血)的限制：50mL管的總體積不應(yīng)超過(guò)30mL。

(5) 小心蓋上CSTFB。

2. CSTFB密度離心和PBMC收集

(1) 保持試管直立，輕輕轉(zhuǎn)移到離心機(jī)上。

(2) 800 ~ 1000 x g, 15℃~ 30℃離心15分鐘，關(guān)閉剎車(chē)。(一些樣品在1000g離心PBMC分離的效果可以改善。如果降速過(guò)程中存在剎車(chē)，就會(huì)破壞分層。)

(3) 離心時(shí)，準(zhǔn)備新無(wú)菌離心管；這將與上一步中使用的管子數(shù)量相同。用樣品識(shí)別號(hào)標(biāo)記每個(gè)試管。

(4) 輕輕將CSTFB從離心機(jī)中取出，以免擾亂各層。

(5) 離心使試管（包括 Frit層）的內(nèi)容物分成六個(gè)不同的層。

(6) 檢查管里是否有以下可能的問(wèn)題。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求記錄觀(guān)察結(jié)果和采取的后續(xù)行動(dòng)。

①、血漿+生理鹽水溶液層。

②、離心后在 Frit上可見(jiàn)凝塊。

③、由于離心速度，時(shí)間或制動(dòng)錯(cuò)誤，PBMC層較差。PBMC層小而模糊，血漿+生理鹽水層可能略有混濁。

④、由于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)或紅細(xì)胞比容低，在 Frit上形成PBMC層。

(7) 每個(gè)樣品使用新的無(wú)菌移液管去除上層淡黃色血漿+鹽水溶液的組分，至云狀白色PBMC帶（位于血漿+鹽溶液層界面和透明分離介質(zhì)溶液間）的上方約1~2厘米的位置。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室政策，丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色PBMC帶可通過(guò)上層小心插入移液器移至PBMC帶。）

(8) 使用無(wú)菌血清學(xué)移液器收集上述PBMC帶處的所有細(xì)胞。注意不要吸入多于必要的分離介質(zhì)溶液。

(9) 將收集到的細(xì)胞從一個(gè)CSTFB轉(zhuǎn)移到一個(gè)相應(yīng)的、預(yù)標(biāo)記的無(wú)菌離心管。管子可以預(yù)先添加鹽水溶液以節(jié)省時(shí)間（50mL管加25mL生理鹽水溶液）。之后進(jìn)行洗滌步驟。

(10) 將含有剩余的紅細(xì)胞和分離介質(zhì)CSTFB重新蓋上蓋子。按照實(shí)驗(yàn)室政策，將CSTFB作為生物危害廢物丟棄。

 

 

圖2 pre-filled Frit Barrier管離心結(jié)果

 

• 手動(dòng)密度梯度介質(zhì)覆蓋或襯底分離細(xì)胞 （Ficoll分離）

 

分離單核細(xì)胞常使用Ficoll作為分離液的主要成分，F(xiàn)icoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400000，當(dāng)密度為1.2g/ml時(shí)也未超出正常生理性滲透壓，也不穿過(guò)生物膜。

通過(guò)Ficoll密度梯度離心，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大于分離液比重，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單核細(xì)胞，并進(jìn)行之后的培養(yǎng)與檢測(cè)。

 

步驟：

1. 血液稀釋

(1) 打開(kāi)抗凝血管的蓋子。

(2) 在每根離心管上標(biāo)上樣品識(shí)別號(hào)（50mL管加12 ~ 22mL血，15mL管加4至5mL血）。

(3) 將血液移入無(wú)菌、有標(biāo)記的15或50mL離心管中，根據(jù)制備密度梯度的試劑盒說(shuō)明加入足夠的生理鹽水來(lái)稀釋血液（血液與稀釋液的最大比例應(yīng)為2:1）。

2. 密度梯度細(xì)胞分離

（兩種方法：（1）覆蓋overlay，先制備梯度在加樣品；（2）襯底u(yù)nderlay，先加樣品再加梯度。加完后蓋好蓋子。）

3. 淋巴細(xì)胞密度離心和PBMC收集

(1) 保持試管直立，輕輕地轉(zhuǎn)移到離心機(jī)。

(2) 按照說(shuō)明書(shū)概述，在15~30°C條件下，400 x g離心30分鐘，關(guān)閉制動(dòng)器。（如果降速過(guò)程中存在制動(dòng)會(huì)破壞分離層。離心機(jī)制動(dòng)器必須關(guān)閉以使分離干凈，并最大限度地回收pbmc。）

(3) 離心使管內(nèi)內(nèi)容物分成四層。

 

 

圖3 ficoll密度梯度離心結(jié)果

 

(4) 在離心管進(jìn)行離心時(shí)，準(zhǔn)備新的無(wú)菌離心管。這將與上一步驟中使用的管子數(shù)量相同。用樣品識(shí)別號(hào)標(biāo)記每個(gè)試管。

(5) 離心完成后從離心機(jī)上取下離心管。

(6) 如果看不到細(xì)胞層，確認(rèn)離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)正常。糾正你發(fā)現(xiàn)的任何問(wèn)題。重新離心試管。記錄問(wèn)題和在研究記錄中采取的行動(dòng)。

①、如果再離心后細(xì)胞層仍然不可見(jiàn)，記錄，移除和丟棄鹽溶液上清，然后繼續(xù)。

②、如果血漿層非常渾濁，可能很難看到血漿層與密度梯度介質(zhì)的界面。用10mL移液管除去界面上方的大部分血漿可改善淋巴細(xì)胞的收集，例如只留下0.5厘米的血漿層。為了收集細(xì)胞要求更好地定位移液器的尖端。

(7) 每份樣品使用新的無(wú)菌移液器，去除上層黃色血漿+生理鹽水溶液的組分，至渾濁白色PBMC帶的上方大約1~2cm的位置（位于血漿+生理鹽水溶液淡黃色組分和密度梯度分離介質(zhì)溶液間）。按實(shí)驗(yàn)室政策丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色PBMC帶可通過(guò)上層小心插入移液器移至PBMC帶。）

(8) 使用無(wú)菌移液管，在PBMC帶（濁白處）收集所有細(xì)胞。注意不要吸入更多的分離介質(zhì)溶液。

(9) 將收集到的細(xì)胞從一個(gè)錐形離心管轉(zhuǎn)移到另一個(gè)相應(yīng)的、預(yù)標(biāo)記的無(wú)菌離心管。離心管可以預(yù)先填充生理鹽水以節(jié)省時(shí)間。之后進(jìn)行洗滌。

4. 重新蓋上裝有剩余紅細(xì)胞/分離物的錐形離心管。按照實(shí)驗(yàn)室政策，將試管作為生物危害廢物進(jìn)行培養(yǎng)基和丟棄。

流式細(xì)胞術(shù)
涉及到流式細(xì)胞儀的使用的一種免疫細(xì)胞分離技術(shù)，流式細(xì)胞儀是一種根據(jù)大小、形狀和熒光亮度等特征標(biāo)記不同顆粒的儀器。這種方法被稱(chēng)為熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，它允許樣品流過(guò)一個(gè)管子，然后將成分分成不同的組。

FACS需要昂貴的設(shè)備和受過(guò)適當(dāng)訓(xùn)練的人員。這種技術(shù)在分選需要許多不同群體的不同細(xì)胞樣本時(shí)很有用，但使用這種方法分離白細(xì)胞非常耗時(shí)。通常，在使用流式細(xì)胞術(shù)處理之前，樣品應(yīng)首先進(jìn)行“制備”或清理，以分離原始樣品內(nèi)容物的特定子集，這可以減少細(xì)胞分選所需的時(shí)間，因?yàn)闄C(jī)器將處理更小、更濃縮的樣品量。這樣還可以產(chǎn)生更多健康的、有活力的細(xì)胞，因?yàn)楫?dāng)處理時(shí)間大大減少時(shí)，自然細(xì)胞死亡就會(huì)減少。

Magnetic-activated cell sorting (MACS) 磁激活細(xì)胞分選
另一種方法是將磁珠與靶細(xì)胞結(jié)合，并使樣品通過(guò)磁場(chǎng)，使附著磁鐵的細(xì)胞懸浮。磁激活細(xì)胞分選(MACS)比前面提到的兩種方法更快、更便宜，但它的細(xì)胞損失是三種方法中最高的。強(qiáng)烈的磁場(chǎng)會(huì)使細(xì)胞破裂、細(xì)胞器破裂、使樣品混亂。這種細(xì)胞外碎片可引起結(jié)塊和阻塞，從而導(dǎo)致較低的吞吐量。

隨著科技和技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信會(huì)有更好的免疫細(xì)胞分離技術(shù)不斷涌現(xiàn)，我們也會(huì)繼續(xù)關(guān)注相關(guān)發(fā)展，以便為顧客提供更好的服務(wù)。