酵母表達是指通過基因克隆技術，將外源目的基因構建到表達載體上，并轉化至酵母細胞中進行穩(wěn)定表達，從而獲得大量目的蛋白的方法。通過查閱相關文獻資料，本文匯總了酵母表達實驗過程中常見的問題，分析了可能存在的原因以及解決辦法。
1、問：用畢式酵母表達蛋白，小量表達并做SDS-PAGE有一條類似三聚體的條帶。大量表達時在FPLC上可以看到一個大峰，但跑電泳卻沒有發(fā)現(xiàn)條帶？
答：在FPLC上可以看到一個大峰，但跑電泳卻沒有發(fā)現(xiàn)條帶，可能的原因有：
（1）上樣時沒有目的蛋白，可能是蛋白沒表達或親和層析時沒洗脫或是穿透了;
（2）目的蛋白結合在FPLC柱子上沒被洗脫;
（3）目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是鹽分峰;
（4）電泳時沒跑好,目的蛋白沒被檢測到.
2、問：用G418篩轉化有多拷貝的細胞株,篩了兩次,四個梯度0.5 mg/ml,1 mg/ml,2 mg/ml,4 mg/ml.結果都沒長出細胞，空載體對照也沒長出。載體是pPIC9K。用電轉涂于MD固體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)轉化效率較低，每塊板長出十幾個點，是否是轉化效率低導致的?
答：可以從以下幾點入手：
（1）挑取酵母單菌落，接種至含有5 ml YPD培養(yǎng)基的50 ml三角瓶中，30℃、250~300 r/min培養(yǎng)過夜;取100-500 μl的培養(yǎng)物接種至含有500 ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250~300 r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達到1.3~1.5。
（2）電擊后馬上加入1ml冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體混勻。
（3）推薦：電壓1.5 kV;電容25 μF;電阻200 Ω。電擊時間為4~10 msec。
3、感受態(tài)制備關鍵點：
甘油的質量，水的質量，最好是超純的，如果要求完美，洗瓶不要有洗滌劑殘留，先將瓶裝滿超純水高壓，再棄去，再配置10%甘油。收菌以半對數(shù)期合適，一般OD0.5收菌，過則不佳，直接取-80℃菌種搖，次日轉種，從盤上菌落搖的要差，33-34℃搖菌結果更理想。
在以冰冷10%甘油等量，半量，1/4量洗滌時一定低溫，重懸時應輕震蕩，棄洗滌液應倒干靜，那怕?lián)p掉部分細菌。最后大概500 ml能做3-4 ml感受態(tài)，液氮中凍10 min轉-80℃冰箱，也可不冷凍，直接用來轉化。
感受態(tài)應以標準濃度質粒電轉記算效率，一般大于10 ⁹/mg，操做以1 ng/ul質粒1 ul加40 ul感受態(tài)置0.1杯，電轉后以最快的速度加入1 ml soc復活，100-150轉搖1h，取1/1000鋪盤應大于1000個菌生長。這樣用于建庫工作才行。
電轉時質�；蜻B接物盡可能少，以減少離子，實際上離子高，電流直接通過，沒有場強，質粒是進不去的。
總結：
（1）任和有關東西都要干凈，保證沒有離子。
（2）從接觸甘油開始就保持恒0℃。
（3）電擊后復活要快。
4、問：轉化了一個基因到畢赤酵母，蛋白有表達，但pcr無論如何也檢測不到陽性的特性條帶，該如何改進？
答：提取酵母DNA當模板時，不能按操作手冊說明的模板的用量進行PCR，而應該降低模板的用量，一般在ng水平已足夠。譬如，挑取單菌落于3 mL適宜培養(yǎng)液中，搖菌過夜，用試劑盒提取酵母DNA，取1uL提取產(chǎn)物作為模板進行PCR鑒定已足夠。
參考步驟
（1）直接用槍尖或者牙簽取單克隆到10 ul無菌去離子水中;
（2）加5 ul 5 u /ul的溶細胞酶(SIGMA);
（3）37℃孵育30分鐘;
（4）-70℃15分鐘;
（5）煮沸5分鐘;
（6）12000 rmp離心5分鐘;
（7）取上清5 ul到50 ul PCR反應體系。
5、問：表達3KD左右的抗菌肽，電泳沒有目的蛋白，表達小肽有哪些注意的方面?
答：首先確定蛋白是不是沒有分泌，看看菌體蛋白中有沒有，如果沒有的話：
第一、構建多種分泌表達載體，看看各種表達載體因素如載體整合方式，整合拷貝數(shù)，5'非翻譯區(qū)及甲醇利用表型對表達量的影響。
第二、一般來說發(fā)酵灌較搖瓶培養(yǎng)表達量更高（10-20倍）。
第三、選用酵母偏愛密碼子。
第四、選用蛋白酶缺陷型得宿主菌如SMD1168等。
6、問：用畢赤酵母表達蛋白（非表達分泌型），經(jīng)常會遇到表達量挺高的，但破完細胞后發(fā)現(xiàn)目的蛋白都在沉淀中沒法往下純化，請問這是為什么?
答：表達量高的話,表達的蛋白很容易出現(xiàn)不正確的折疊而形成不溶性的產(chǎn)物，因此要提高可溶性蛋白的表達量，最好不要讓目的基因過量表達�？刹扇∫恍┲T如降低溫度等的措施。