不同細(xì)胞種類(lèi)、來(lái)源、實(shí)驗(yàn)要求和目的選擇不同細(xì)胞純化方法的介紹
體外培養(yǎng)細(xì)胞源于動(dòng)物機(jī)體，而機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞都混雜生長(zhǎng)，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，從體內(nèi)取得的培養(yǎng)材料所做的原代培養(yǎng)，絕大多數(shù)都是各種細(xì)胞混合生長(zhǎng)。其主要表現(xiàn)為兩大類(lèi)，即上皮樣細(xì)胞和纖維樣細(xì)胞。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中即使都是纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞，它們也有種類(lèi)的不同，如纖維樣細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等。而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究都要求采用單一種類(lèi)細(xì)胞，這樣才能對(duì)某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等的變化進(jìn)行研究，因此培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。
細(xì)胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類(lèi)�？筛鶕�(jù)不同細(xì)胞種類(lèi)、來(lái)源、實(shí)驗(yàn)要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法
一、自然純化
3. 反復(fù)貼壁法
（2）方法：將細(xì)胞懸液接種到一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（最好用無(wú)血清培養(yǎng)，因?yàn)樵跓o(wú)血清支持下，上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置 20 min；在顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞部分貼壁，稍加搖蕩也不浮起時(shí)，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁細(xì)胞一起倒出或吸到另一培養(yǎng)瓶；繼續(xù)培養(yǎng)或重復(fù)上述操作，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞逐步分隔開(kāi)。
4. 克隆法
細(xì)胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類(lèi)�？筛鶕�(jù)不同細(xì)胞種類(lèi)、來(lái)源、實(shí)驗(yàn)要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法
一、自然純化
自然純化即利用某一種類(lèi)細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，排擠其他細(xì)胞生長(zhǎng)，靠自然的增殖潛力最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無(wú)法人為的選擇細(xì)胞，時(shí)間長(zhǎng)，多數(shù)情況下，剩下的都是成纖維細(xì)胞，因此，僅有些惡性腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)此方法，自然純化而建立細(xì)胞系。
二、人工純化
利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。
1. 酶消化法
①概述：由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶比較敏感，而上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性較高，因此，在消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，特別是原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期,這種差異尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi)達(dá)到純化細(xì)胞的目的。
②方法：采用普通消化傳代方法，將 0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次，每次加 1 mL（25 mL培養(yǎng)瓶），稍加搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)所有細(xì)胞表面，然后倒掉。蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫壁，立即加入 2mL 有血清培養(yǎng)液，終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域（可事先在顯微鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上畫(huà)出記號(hào)）。吹打過(guò)程中不要用力，也不要吹上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，或隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作。經(jīng)過(guò)幾次處理可以將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_(kāi)。
2. 機(jī)械劃除法
2. 機(jī)械劃除法
（1）概述：原代培養(yǎng)成功后，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞多數(shù)都同時(shí)出現(xiàn)，混雜生長(zhǎng)。這種混雜生長(zhǎng)常常分區(qū)呈片，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上。因此可以采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞的區(qū)域，而保留需要的。
（2）方法：將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行。用彎頭滴管在不需要生長(zhǎng)的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞脫壁懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞；推劃后用培養(yǎng)液沖洗兩次，即可加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長(zhǎng)出，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。
3. 反復(fù)貼壁法
（1）概述：成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細(xì)胞常能在 10~30 min 完成附著過(guò)程（但不一定完全伸展）；而上皮細(xì)胞大部分在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起。利用不同細(xì)胞貼壁速度不同的特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)反復(fù)貼壁，可以將早期傳代培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分開(kāi)。
（2）方法：將細(xì)胞懸液接種到一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（最好用無(wú)血清培養(yǎng)，因?yàn)樵跓o(wú)血清支持下，上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置 20 min；在顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞部分貼壁，稍加搖蕩也不浮起時(shí)，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁細(xì)胞一起倒出或吸到另一培養(yǎng)瓶；繼續(xù)培養(yǎng)或重復(fù)上述操作，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞逐步分隔開(kāi)。
4. 克隆法
在同一細(xì)胞系中，存在不同的細(xì)胞株，它們的功能和生長(zhǎng)特點(diǎn)僅略有不同，要純化出某一種細(xì)胞，用上述方法常不能將同一細(xì)胞系的不同株分開(kāi)，可采用細(xì)胞克隆的方法。具體過(guò)程是采用細(xì)胞克隆法將細(xì)胞分成單個(gè)細(xì)胞，使之分別生長(zhǎng)成克隆，然后對(duì)每一克隆進(jìn)行測(cè)試，選擇出所需要的克隆。
5. 培養(yǎng)基限定方法
某些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中必須存在或去除某種物質(zhì)，否則將無(wú)法生長(zhǎng)，而其他細(xì)胞與之相反�？梢岳眠@種技術(shù)來(lái)純化細(xì)胞。如雜交瘤技術(shù)中常用的 HAT 培養(yǎng)液，就用來(lái)篩選雜交瘤細(xì)胞而抑制其他細(xì)胞。
6. 流式細(xì)胞儀分離法
流式細(xì)胞儀可根據(jù)細(xì)胞核酸含量、某些物質(zhì)含量或細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)來(lái)將細(xì)胞分離成不同的群體。
標(biāo)簽：
細(xì)胞純化
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