利用pFastBac1進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)的時候，根據(jù)蛋白純化方式的需要以及融合表達(dá)目的蛋白以提高其表達(dá)量的需要，可以在質(zhì)粒構(gòu)建時添加His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標(biāo)簽影響目的蛋白的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)研究，可在融合蛋白和標(biāo)簽之間添加蛋白酶酶切位點，如TEV或PreScission的酶切位點。如果蛋白主要以可溶形式表達(dá)，離心收集昆蟲細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，但由于昆蟲細(xì)胞內(nèi)蛋白酶種類比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。同時可以利用離子交換、分子篩層析等進(jìn)一步純化目的蛋白。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當(dāng)濃縮后保存等。
蛋白表達(dá)純化詳細(xì)步驟：

一、桿狀病毒制備與鑒定
培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞至密度達(dá)到5×10⁶~1×10⁷活細(xì)胞/ml，活性≥90%。用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成2.5×10⁶活細(xì)胞/ml 稀釋液，27℃、127 r/min 恢復(fù)25 min。用Opti⁃MEM^TMI 無血清培養(yǎng)基稀釋 ExpiFectamine^TMSf 轉(zhuǎn)染試劑，并加入 Bacmid DNA（pc1⁃mfp5以及gus），室溫孵育5 min，隨后滴加到100 ml細(xì)胞稀釋液中。27℃、127 r/min孵育72~96 h至細(xì)胞存活率降至 60%~80%，300×g 離心 5 min，保留上清即P0代病毒。
使用 ExpiSf^TMCD 培養(yǎng)基制備連續(xù) 10 倍的病毒稀釋液（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5），并在培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至1.25×10⁶活細(xì)胞/ml。將1 ml 病毒稀釋液添加到24深孔板中（每個稀釋液1孔），隨后將1 ml ExpiSf^TMCD培養(yǎng)基添加到無病毒的陰性對照中。將800 μl細(xì)胞懸液添加到8個病毒稀釋液以及陰性對照孔中，并在27℃、227 r/min 搖床中避光孵育14~16 h。將24深孔板中細(xì)胞分別取出，300×g離心5 min，棄上清。細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 稀釋的gp64APC抗體中，渦旋 3~5 s，室溫孵育 30 min，PBS洗滌后重懸于1 ml胎牛血清稀釋液中，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。

二、蛋白表達(dá)與鑒定
培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)胞密度達(dá)到 5×10⁶~1×10⁷活細(xì)胞/ml，活性≥90%，用培養(yǎng)基稀釋至最終密度為5×10⁶活細(xì)胞/ml，立即加入ExpiSf^TM轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，在127 r/min，27℃搖床上孵育18~24 h。當(dāng)細(xì)胞密度恢復(fù)至5×10⁶~7×10⁶活細(xì)胞/ml，活性≥80%時分別使用病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI，平均每個細(xì)胞的病毒感染數(shù)）30、60 以及 120的桿狀病毒感染細(xì)胞，27℃、127 r/min培養(yǎng)直至細(xì)胞活性降至30%以下，300×g離心5min取上清。取200 μl細(xì)胞上清液以及細(xì)胞裂解液分別加入50 μl 5×SDS緩沖液，沸水煮6 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，在90 V、90 min的狀態(tài)下電轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證目的蛋白的表達(dá)情況”，純化之后還可以通過SDS-PAGE驗證，結(jié)合灰度分析驗證蛋白的純度
 
卡梅德生物擁有完善的昆蟲表達(dá)純化體系，昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)適合于膜蛋白的重組表達(dá)，4次及以下跨膜蛋白幾乎可以有效地在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和純化。膜蛋白的純化是一件比較耗時耗力的事情，卡梅德生物科技可以提供高純度的全長膜蛋白定制產(chǎn)品。我們可以為客戶提供整套的蛋白表達(dá)方案，我們免費對客戶提供的基因進(jìn)行序列分析檢測；同時根據(jù)Sf9，Sf21，Hi-5及S2昆蟲細(xì)胞的密碼子偏愛性，免費為您進(jìn)行密碼子優(yōu)化，從而有效提高重組蛋白表達(dá)量，為您提供一站式服務(wù)。如需提供昆蟲表達(dá)純化幫助，請瀏覽卡梅德生物科技有限公司網(wǎng)站。