1. 什么是載體構(gòu)建技術(shù)？
載體構(gòu)建（Vectorcon Struction）是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的常用手段之一，使用該技術(shù)將外源DNA片段插入至人工構(gòu)建的質(zhì)粒中，目的是把連接好的DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞當(dāng)中進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增用于后續(xù)的科研試驗(yàn)。
 
2. 常用的載體構(gòu)建方法？
目前常用的載體構(gòu)建技術(shù)包括重疊延伸PCR法、傳統(tǒng)的酶切連接法以及同源重組法等。傳統(tǒng)的酶切連接法是用相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒和含有目的片段DNA進(jìn)行消化，得到具有相同的粘性末端或平末端的線性DNA，純化酶切產(chǎn)物，再利用DNA連接酶片段與載體相連，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行后續(xù)的篩選、擴(kuò)增。同源重組克隆技術(shù)通過同源重組酶將兩個(gè)具有相同末端序列的線性化載體和插入片段重組成重組質(zhì)粒，同樣轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行篩選、擴(kuò)增。
 
3.  常用的載體構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)？
原核系統(tǒng)表達(dá)載體：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)要求載體包含SD序列、一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子及其兩側(cè)的調(diào)控序列、啟動(dòng)子與外源基因之間有正確的閱讀框架以及外源基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。最常用的載體是pET系列和pGEX系列。卡梅德生物通過密碼子優(yōu)化、改造表達(dá)載體元件以及融合標(biāo)簽與宿主的多樣性選擇等實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效率表達(dá)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體：包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等控制元件，載體選擇主要為pcDNA3.1系列和pcDNA4系列。卡梅德生物設(shè)計(jì)的高表達(dá)載體能為客戶提供高表達(dá)水平的重組蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)與制備服務(wù)。
酵母質(zhì)粒載體：由選擇標(biāo)記（例如營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記HIS3、抗生素篩選標(biāo)記氯霉素等）和調(diào)控序列（包括啟動(dòng)子、ARS、2μM質(zhì)粒、酵母著絲粒區(qū)段等），載體選擇主要為pPIC9系列和pPIC3.5系列�？�梅德生物能夠同時(shí)為客戶提供多種規(guī)格的蛋白酵母發(fā)酵規(guī)格、配合蛋白純化平臺(tái)，在短時(shí)間內(nèi)獲得高質(zhì)量的重組蛋白。
昆蟲表達(dá)載體：桿狀病毒表達(dá)載體是以Sf9和Sf21細(xì)胞系以及家蠶為表達(dá)宿主，將外源基因克隆于轉(zhuǎn)移載體上，與病毒DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，經(jīng)同源重組和篩選而得到重組病毒。載體選擇主要為pFastBac1系列和pFastBacHT系列。卡梅德生物根據(jù)Sf9，Sf21，Hi-5及S2昆蟲細(xì)胞的密碼子偏愛性，免費(fèi)為您進(jìn)行密碼子優(yōu)化，從而有效提高重組蛋白表達(dá)量。

4. 載體構(gòu)建的基本流程？
4.1酶切連接法
（1）載體選擇：
根據(jù)構(gòu)建重組質(zhì)粒的目的不同選擇合適的載體，并對(duì)目的片段與載體含有的酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析。
（2）引物設(shè)計(jì)：
能與目的片段特異性結(jié)合并進(jìn)行擴(kuò)增，引物長度約18-25bp，GC含量在40%-60%之間，需要加入兩個(gè)合適的酶切位點(diǎn)。
（3）PCR擴(kuò)增：
以研究對(duì)象的DNA/cDNA為模版，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的片段后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和回收目的基因條帶。
（4）載體和目標(biāo)片段的限制性酶切：
使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，對(duì)目的片段和質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切實(shí)驗(yàn)。加樣全程于冰上操作，用移液槍吹勻樣品，輕彈管底去除氣泡后再用掌心離心機(jī)將樣品甩至管底，最終于37℃水浴鍋內(nèi)酶切1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，若條帶位置正確則對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)物回收。
（5）連接轉(zhuǎn)化：
使用T4 DNA Ligase對(duì)酶切后的回收產(chǎn)物進(jìn)行酶連。該酶在16℃條件下對(duì)粘性末端連接效率很高，酶連過夜即可充分連接。
（6）挑取單克隆提取質(zhì)粒驗(yàn)證：
菌液PCR：將單克隆菌落挑至含有相應(yīng)抗性的1.5 mL EP管中培養(yǎng)4~5 h，按照擴(kuò)增目的片段所用的PCR體系加入各組分，其中將模板DNA為菌液（體積1 µL），同時(shí)設(shè)置水為模板的陰性對(duì)照組以及擴(kuò)增的目的片段作為陽性對(duì)照組。反應(yīng)完畢后將所有樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶亮度以及位置初步判斷是否酶連成功。
酶切驗(yàn)證：以目的片段的雙酶切組作為陽性對(duì)照，以空載的雙酶切組作為陰性對(duì)照，將反應(yīng)后樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。若樣品組有與陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組位置一致的兩條帶，則進(jìn)一步證明該重組質(zhì)粒連接成功。
測序驗(yàn)證：送至測序公司，比對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
4.2同源重組法
（1）載體線性化：使用限制性內(nèi)切酶消化法或反向PCR擴(kuò)增法，選擇合適的克隆位點(diǎn)對(duì)載體進(jìn)行線性化。
（2）插入片段的獲得：在插入片段正反向擴(kuò)增引物的5’端引入線性化載體兩末端同源序列，使擴(kuò)增后的插入片段5'和3'最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)一致的同源序列（15-20 bp，不包括酶切位點(diǎn)）。
（3）重組反應(yīng)：回收瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物，根據(jù)測得的濃度計(jì)算重組反應(yīng)所需的線性化載體和插入片段所需DNA量。
（4）轉(zhuǎn)化感受態(tài)
（5）重組反應(yīng)產(chǎn)物鑒定：菌液PCR、測序。

                             圖1 表達(dá)質(zhì)粒示意圖
 
5. 同源重組法與傳統(tǒng)酶切法的對(duì)比？
同源重組法對(duì)酶切位點(diǎn)的依賴性較低，構(gòu)建耗時(shí)較短，構(gòu)建過程簡單可以省去很多精力，但假陽性率略高。
傳統(tǒng)酶切法應(yīng)用的時(shí)間長、技術(shù)成熟，但依賴于酶切位點(diǎn)的選擇，酶切效率與連接效率低且構(gòu)建過程比較繁瑣。
 
6. 載體構(gòu)建技術(shù)的應(yīng)用？
（1）構(gòu)建克隆載體用于擴(kuò)增目的基因；（2）構(gòu)建表達(dá)載體用于表達(dá)目的基因；（3）構(gòu)建基因編輯載體用于編輯基因；（4）構(gòu)建病毒包裝載體用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。