基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不同基因編輯方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞系中，而在魚類細(xì)胞系中進(jìn)行遺傳操作的研究較少。利用CRISPR/Cas9進(jìn)行細(xì)胞系基因編輯主要包括以下幾個步驟：如靶向目的基因的gRNA設(shè)計、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因編輯效率的確定、單細(xì)胞克隆的建立，以及突變細(xì)胞系的特征鑒定等。每個過程都需要克服相應(yīng)的障礙，特別是對于魚類細(xì)胞系，以低轉(zhuǎn)染效率聞名。相比哺乳動物細(xì)胞系，魚類細(xì)胞系的培養(yǎng)溫度較低、細(xì)胞膜磷脂飽和度較高，使得磷脂雙分子層更加堅硬，外源DNA進(jìn)入細(xì)胞更加困難。
 

雖然利用病毒載體進(jìn)行質(zhì)粒傳遞的方式具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但是病毒載體存在兩個缺點：一是CRISPR/Cas9元件的長時間表達(dá)會導(dǎo)致脫靶效應(yīng)的概率增加，二是病毒DNA可能會整合到宿主基因組中而導(dǎo)致插入突變事件。此外，由于鮭科魚類細(xì)胞生長緩慢以及魚類單克隆細(xì)胞系培養(yǎng)困難，此前還沒有分離經(jīng)過基因編輯的虹鱒魚（Oncorhynchus mykis）克隆細(xì)胞系。為了便于在魚類細(xì)胞系中進(jìn)行遺傳操作，瑞士聯(lián)邦水產(chǎn)科學(xué)和技術(shù)研究所、蘇黎世大學(xué)實驗動物科學(xué)研究所及環(huán)境系統(tǒng)科學(xué)系的Marina Zoppo和Nicole Okoniewski等人在Cell & Bioscience期刊上發(fā)表了題為“A ribonucleoprotein transfection strategy for CRISPR/Cas9‐mediated gene editing and single cell cloning in rainbow trout cells”的研究論文。在本研究中，作者以在虹鱒魚腸道細(xì)胞系RTgutGC中敲除cyp1a1基因為例，建立了一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯魚類細(xì)胞系的方法，并獲得了cyp1a1基因突變的單克隆細(xì)胞系。
 

 

本次實驗中，研究人員使用了NEPA GENE公司的NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對RTgutGC細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。為確定最適合RTgutGC細(xì)胞電穿孔的參數(shù)，設(shè)置了11次電穿孔條件，當(dāng)參數(shù)為電壓150V、脈沖時間5ms、脈沖間隔50ms、脈沖次數(shù)2次的程序時，轉(zhuǎn)染效率最高，經(jīng)過優(yōu)化后標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（pEGFP-C1-Flag）的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到78%。
 

隨后，研究人員先將cas9蛋白與crRNA:tracrRNA-ATTO™550雙鏈合成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物（圖1a）。采用上述電穿孔參數(shù)，對RTgutGC細(xì)胞進(jìn)行電穿孔并將RNP復(fù)合物導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，用以敲除cyp1a1基因（圖1b）。電穿孔48h后，使用ATTO™550信號進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選，并在96孔板中培養(yǎng)后依次傳到更大的細(xì)胞培養(yǎng)孔板上，以便提取細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行基因分型。最后，采用T7內(nèi)切酶（T7EI）分析和ICE分析分別評估CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的基因編輯效率和突變的性質(zhì)，最后通過低密度接種和克隆環(huán)細(xì)胞分離法獲得克隆細(xì)胞（圖1b）。
 

圖1 在RTgutGC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物。a. RNP的合成過程；b.細(xì)胞電轉(zhuǎn)染及CRISPR/Cas9基因編輯流程。

研究人員對cyp1a1基因的crRNA分析表明，cyp1a3中存在一個假定的脫靶位點，cyp1a3是一個屬于CYP1A亞家族的基因，與目標(biāo)基因cyp1a1有96%的核苷酸同源性。但是在PAM近端區(qū)域存在單個堿基對錯配，這表明可能不會發(fā)生脫靶切割現(xiàn)象。T7EI檢測結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染RNP的細(xì)胞cyp1a1擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條與野生型產(chǎn)物對應(yīng)的DNA條帶。但是轉(zhuǎn)染RNP的細(xì)胞cyp1a1擴(kuò)增產(chǎn)物被切割成三條帶，對其DNA條帶強(qiáng)度進(jìn)行評估，cyp1a1的基因編輯效率約為39%（圖2a-b）。此外，從轉(zhuǎn)染RNP和未轉(zhuǎn)染RNP細(xì)胞中擴(kuò)增出cyp1a3基因，未檢測到切割產(chǎn)物，表明結(jié)果與預(yù)期相符（圖2b）。

此外，作者從轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的RTgutGC細(xì)胞中擴(kuò)增出RNP復(fù)合體靶向的cyp1a1 DNA區(qū)域，并進(jìn)行Sanger測序。結(jié)果表明，在crRNA靶向的區(qū)域有重疊的峰，進(jìn)一步證實了cyp1a1基因的編輯（圖2b）。同時，使用ICE分析表明，在Cas9切割位點檢測到不同長度的基因插入或缺失（從−5核苷酸到+1核苷酸），與非同源性末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑相兼容（圖2c）。ICE分析cyp1a1基因的總體編輯效率為34%，與Sanger測序之間具有良好的相關(guān)性（R²=0.98）。
 

圖2 RTgutGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行T7E1檢測和ICE分析。a. 左側(cè)為T7EI檢測示意圖；右側(cè)為T7E1檢測結(jié)果，（1）RNP轉(zhuǎn)染組RTgutGC細(xì)胞的cyp1a1；（2）未轉(zhuǎn)染組RTgutGC細(xì)胞的cyp1a1；（3）RNP轉(zhuǎn)染組RTgutGC細(xì)胞的cyp1a3；（4）未轉(zhuǎn)染組RTgutGC細(xì)胞的cyp1a3；（5）T7E1檢測陽性對照；每個泳道上的數(shù)據(jù)為基因編輯效率。b. Sanger測序結(jié)果。c. 電轉(zhuǎn)染RNP細(xì)胞的ICE分析結(jié)果。

值得一提的是，作者本想通過流式細(xì)胞儀分選法或連續(xù)稀釋法分離出經(jīng)基因編輯的RTgutGC細(xì)胞克隆，但均以失敗告終。最后，采用了克隆環(huán)細(xì)胞分離法成功分離出兩株cyp1a1基因突變的RTgutGC細(xì)胞系。作者分析可能主要存在兩個因素：一是魚類細(xì)胞系生長緩慢，二是細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要其他細(xì)胞釋放生長因子。經(jīng)鑒定，兩株cyp1a1基因突變細(xì)胞系分別在PAM序列之前的第3個核苷酸發(fā)生1個和101個核苷酸的插入，均導(dǎo)致了cyp1a1 ORF的移碼，使得終止密碼子提前。
 

在本研究中，作者借助NEPA GENE品牌的NEPA21基因高效轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將RNP復(fù)合物導(dǎo)入難轉(zhuǎn)染的魚類細(xì)胞系RTgutGC中，成功地開發(fā)了一種CRISPR/Cas9方法來編輯虹鱒細(xì)胞系RTgutGC，以及一種分離經(jīng)過基因編輯的克隆細(xì)胞的方法。這是首次報道虹鱒CRISPR編輯的克隆細(xì)胞系，為將來分離虹鱒魚和其他魚類細(xì)胞系的克隆細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

NEPA21基因高效轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計的電轉(zhuǎn)程序，電壓衰減（Voltage Decay）模式；基因?qū)��?反向?qū)�入模式。不需要特殊轉(zhuǎn)染試劑輔助，節(jié)省實驗成本；電轉(zhuǎn)程序中的各項參數(shù)實時可見、可調(diào)，特別適用于優(yōu)化原代細(xì)胞、非常見細(xì)胞的電轉(zhuǎn)參數(shù)。
 

論文鏈接：

https://linkspringer.53yu.com/article/10.1186/s13578-021-00618-0

參考文獻(xiàn)：

Zoppo M, Okoniewski N, Pantelyushin S, et al. A ribonucleoprotein transfection strategy for CRISPR/Cas9‐mediated gene editing and single cell cloning in rainbow trout cells[J]. Cell & Bioscience, 2021, 11(1): 103.

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