1. 什么是雙特異性納米抗體

雙特異性抗體（Bispecificantibody，BsAb）是1960年Nisonoff 團(tuán)隊(duì)首次提出，是一種可以同時(shí)結(jié)合兩種特異性表位或目的物的人工工程化抗體。2009年首個(gè)BsAb藥物Catumaxomab被歐盟批準(zhǔn)上市，給腫瘤治療帶來了新的希望。
雙特異性納米抗體是指利用基因工程技術(shù)對納米抗體進(jìn)行人工改造，形成新的雙特異性納米抗體分子，并保持其優(yōu)異的性能，從而在抗體工程應(yīng)用領(lǐng)域具有良好的前景。

圖1：雙特異性納米抗體

2. 納米抗體及優(yōu)點(diǎn)

羊駝是駱駝科的成員，包括美洲駝（Llama）以及我們熟悉的羊駝（Alpaca）。除常規(guī)IgG外，駝科動(dòng)物還產(chǎn)生一種功能性單鏈抗體，該抗體能夠與抗原結(jié)合，即為納米抗體，有時(shí)稱為VHH抗體。納米抗體（Nanobody, Nb 晶體為2.5nm，長4nm，分子量只有15KDa。這些抗體僅由重鏈組成，缺乏輕鏈和功能性CH1和CH4結(jié)構(gòu)域。這些所謂的重鏈抗體正被用于開發(fā)單域抗體。這些抗體的單結(jié)構(gòu)域性質(zhì)提供了獨(dú)特的優(yōu)勢，使其在生物技術(shù)應(yīng)用中脫穎而出。

納米抗體的優(yōu)點(diǎn)：

（1）在高溫和pH下的穩(wěn)定性；
（2）VHH可以識(shí)別通常不被常規(guī)抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)；
（3）它們的小分子片段有助于快速組織滲透和標(biāo)記應(yīng)用，包括跨越血腦屏障；
（4）用于大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約成本的替代品。

3. 納米抗體的制備

相比較傳統(tǒng)的單克隆抗體，納米抗體的制備具有很大優(yōu)勢�？梢愿爬�為免疫羊駝獲得抗體基因和噬菌體展示來獲得目的抗體序列。主要分為羊駝免疫，噬菌體文庫構(gòu)建，篩選抗體庫、抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證四個(gè)步驟。

3.1羊駝免疫

挑選適齡羊駝→準(zhǔn)備抗原→免疫羊駝→采血測定效價(jià)→PBMC細(xì)胞分離

3.2 噬菌體文庫構(gòu)建

RNA提取→cDNA反轉(zhuǎn)錄合成→PCR擴(kuò)增→連接載體并電轉(zhuǎn)化→細(xì)菌文庫/噬菌體文庫建立

3.3 抗體庫篩選

常規(guī)使用的篩選方法是固相篩選，磁珠和細(xì)胞篩選，卡梅德生物可以根據(jù)客戶需求提供定制化的篩選體系。

3.4 抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證

構(gòu)建哺乳表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)→過鎳柱純化→親和力測定

圖2：Fc-VHH納米抗體表達(dá)結(jié)果圖片

4. 雙特異性納米抗體的制備

雙特異性抗體制備的方法目前主要有化學(xué)偶聯(lián)法、雙雜交瘤融合法、重組基因法。
（1）化學(xué)偶聯(lián)法：原理是通過化學(xué)偶聯(lián)劑（如鄰苯二馬來酰亞胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸鹽、二硫代酰基苯甲酸等）將兩個(gè)完整IgG或兩個(gè)F(ab)2抗體片段偶聯(lián)成一種BsAb，優(yōu)點(diǎn)是方法操作簡單，速度快，缺點(diǎn)是容易致癌。
（2）雙雜交瘤融合法：利用細(xì)胞融合技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞系，然后對特定的抗體進(jìn)行分離。雜交瘤細(xì)胞系制備會(huì)讓重鏈-輕鏈抗體隨機(jī)結(jié)合，因此制備的雙特異性抗體具有隨機(jī)性，效率比較低。
（3）重組基因法：這種方法可以解決雙雜交瘤融合法重鏈-輕鏈抗體隨機(jī)結(jié)合的問題，是目前最普遍使用的方法。

5. 雙特異性納米抗體構(gòu)建

 由于納米抗體只有一個(gè)重鏈可變區(qū)，雙特異性納米抗體的設(shè)計(jì)避免了雙抗體制備過程中重鏈與輕鏈的錯(cuò)配，從而實(shí)現(xiàn)了通用設(shè)計(jì)，開發(fā)了多種設(shè)計(jì)雙特異性抗體的方法。
（1）VHH可組裝成雙特異性抗體，用于提高抗原結(jié)合的特異性，減少脫靶效應(yīng)，用于同一抗原的不同表位，雙特異性抗體可與不同抗原的納米抗體組合在一起。
（2）為了制備多特異性納米抗體，雙特異性納米抗體可與其它多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合。
（3）FC片段也可用于將VHH與SCFV片段偶聯(lián)產(chǎn)生雙抗，可以增強(qiáng)ADCC或ADCP效應(yīng)。雙特異性納米抗體可以作為CAR-T療法中的工具。CAR-T療法是一種新型的精準(zhǔn)靶向治療腫瘤的療法，即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。利用基因工程技術(shù)，將激活的T細(xì)胞安裝在定位導(dǎo)航裝置CAR(腫瘤嵌合抗原受體)上，將T細(xì)胞打造成“超級戰(zhàn)士”CAR，能準(zhǔn)確、專門地識(shí)別和消除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。 

圖3：納米抗體改造

6. 雙特異性藥物發(fā)展現(xiàn)狀

目前已有3款雙特異性抗體藥物成功上市，先后順序是Catumaxomab（卡妥索單抗）2009年上市，用于惡性腹腔積液的治療；Blinatumomab（博納吐單抗）2014年上市，用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療；Emicizumab2017年上市，用于A型血友病的治療。雙特異性抗體藥物極具市場前景，目前諸多跨國藥企如羅氏、輝瑞等紛紛推出相關(guān)抗體藥物，相信不久的未來，科技不斷發(fā)展會(huì)研發(fā)出更多抗體藥物，為患者帶去希望。