論單通道檢測在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用
論文已發(fā)表在《發(fā)酵科技通訊》2022年4期
由圖 1 可知：在臨界點改變攪拌轉(zhuǎn)速后，細胞快 速進入對數(shù)生長期 。 實驗中根據(jù)臨界點及曲線變化 趨 勢，恰 當 掌握攪拌轉(zhuǎn)速 調(diào) 整時機，滿 足 供 氧 需 求，使植酸酶表達量及酶活均達較高水平 。
2．2．2 利用臨界點進行補料
流加補料－分 批 發(fā) 酵[19－23] 是現(xiàn)代發(fā)酵工 程 普 遍 采用的方式，可以較好地解決底物阻遏，按設(shè)備能力 供氧，減緩代謝有害物的不利影響；尤其對于基因工 程菌高密度發(fā)酵，流加補料是實現(xiàn)高密度發(fā)酵必不 可少的手段 。流加補料技術(shù)的關(guān)鍵是對補料時機的 把握，利用發(fā)酵尾 氣分析曲線中的臨界點能夠比較 精準地掌控補料時機 。
某大型藥企在重 組 大 腸 桿 菌培養(yǎng)白細 胞 介 素－ Ⅱ 生產(chǎn)過程中，在 1t 生產(chǎn)罐上應(yīng)用 FGA 發(fā)酵尾 氣 分析儀，監(jiān)測尾 氣 變 化，其 發(fā) 酵 過 程 CER 曲 線 如 圖 2 所 示 。 由 圖 2 可 以 看 出 CO2 的 整 體 變 化 規(guī) 律： 1) 發(fā)酵開 始 后，CER 先 有 極 短 的 平 緩 區(qū)，很 快 在 1h32min時曲線 出 現(xiàn) 快 速 上 升 的 臨 界 點，預(yù) 示 重 組大腸桿菌生長進入對數(shù)生長期，此時開始流加補 料，并根據(jù) DO反饋值調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，保 持 DO 在 較 高水平 。2) 在 CER迅速上升的對數(shù)生長期，逐漸提 高流加補料速率，在達到峰值，出現(xiàn)臨界點時，流加速 率達到最大 。3) 在 發(fā) 酵 后 期，補 料 速 率 維 持 在 某 一 穩(wěn)定水平，直至發(fā)酵結(jié) 束 。整 個 發(fā) 酵 過 程 約 10h，產(chǎn) 物表達量 占 菌 體 總 蛋 白 的 40％ 。 發(fā) 酵 過 程 中 對 數(shù) 生長期起點和終點(臨界 點) 的 出 現(xiàn) 都 發(fā) 生 在 1 min 內(nèi)，如非采用實時連續(xù)在線檢測是難以觀察到的 。
2．3 利用臨界點進行誘導
在重組大 腸 桿 菌 發(fā) 酵 過 程 中，通 常 采 用 IPTG 誘導劑進 行 誘 導 。 IPTG 誘 導 劑 具 有 一 定 毒 性，對宿主和代謝產(chǎn)物有抑制作用，且 費 用 高 昂，在 工 業(yè) 化 大規(guī)模生產(chǎn)中較難推廣 。乳糖是一種廉價資源，可以 作為碳源被大腸桿菌代謝利用，有報道在重組蛋白培養(yǎng)中用其作誘導劑，但尚不普遍，究其原因，除誘導機 理復(fù)雜外，乳糖誘導時機不易把握也是重要因素 。
張毅 等[24] 在 LB 培 養(yǎng) 基 中，分 別 在 對 數(shù) 生 長 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 對 融 合 蛋 白 表 達 菌 BL21 (DE3)(pFu) 進行 乳 糖 誘 導，發(fā) 現(xiàn)：乳糖的加入會造 成菌體生長遲滯，在 早 期 、中 期 進 行誘導均不理想， 只有在后期進行誘 導 效 果 最 佳，此 時既可以得到較 高的表達產(chǎn)物，又可以獲得較高 的 菌 體 密度 。 有 研 究報道[22－30] 表明：在培養(yǎng)基葡萄糖剛剛耗盡，細胞濃 度增加緩慢或略有下降時開始誘導，效果最佳 。
應(yīng) 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，可 以 直 觀 地 辨 識 菌 體 生長的各個階 段 。 一般在對 數(shù)生長期的后期，即 培 養(yǎng)基中葡萄糖剛剛 耗 盡，細胞濃度增加緩慢或略有 下降時，尾氣分析的 CER 曲線會出現(xiàn)一個由上升轉(zhuǎn) 為下降的臨界點，利用該臨界點可 以方便地確定誘 導時機，及時進行乳糖誘導 。
2．2．4 利用臨界點處理異常發(fā)酵
雖然微生物發(fā)酵是一個非線性時變系統(tǒng)，包含了 生物、化學及物理的各種變化，過程較為復(fù)雜，但是當 各 種 條 件 固 定 后，微 生 物 細 胞 代 謝 又 遵 循 一 定 的 規(guī) 律 。從發(fā)酵尾氣分析得到的大量數(shù)據(jù)來看，在某種發(fā) 酵體系中，當工藝條件確定后，其 分析曲線整體形態(tài) 是確定的，一旦發(fā)生改變，通常 預(yù) 示著某種代謝的改 變 。 因此，捕捉那些異 常 臨 界 點，對異常發(fā)酵的及早 發(fā)現(xiàn)和處理很有意義，特別是對工業(yè)大生產(chǎn)和高附加 值的生物制藥更是如此 。就此而言，尾氣分析的敏感 性和實用性均超過了 pH 、DO等其他現(xiàn)有檢測手段 。
在廣東某高校進行的重組大腸桿菌發(fā)酵 藥 物 蛋 白實驗中，發(fā)酵開始后，經(jīng)過短暫的遲緩期，CO2 曲線 開始緩慢上 升，約 2h 后 發(fā) 酵 快 速 進 入 對 數(shù) 生 長 期； 20min后，CO2 曲 線 突 然 出 現(xiàn) 了 下 折，CO2 體積分數(shù) 迅速下降，在不到 30min 的時間內(nèi)下降到接種前水平， 鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)此時發(fā)酵液中的工程菌已經(jīng)消失，判斷 感染了噬菌體，隨即停止發(fā)酵，并迅速進行滅菌處理。 該實驗過程的 CO2 體積分數(shù)變化曲線如圖 3 所示。
3 實時連續(xù)在線檢測
3．1 實時連續(xù)在線檢測的意義
利 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，特 別 是 利 用 分 析 曲 線 上的臨界點，監(jiān)測發(fā)酵過程中細胞的代謝變化，可以 為發(fā)酵操作及進一步工藝優(yōu)化提供 依 據(jù) 。 發(fā)酵尾氣 分析技術(shù)的關(guān)鍵在于對發(fā)酵過程中尾氣的 CO2 及 O2 進行實時連續(xù)在線監(jiān)測，只有這樣才能捕捉到發(fā)酵狀 態(tài)改變的臨界點，監(jiān)測到細胞代謝狀態(tài)的改變 。 由于 發(fā)酵過程中臨界點的出現(xiàn)和狀態(tài)的改變往往 發(fā) 生 在 極短的時間內(nèi)，所以實時連續(xù)在線檢測尤為重要 。
3．2 采用單通道確保實時連續(xù)在線檢測
隨 著 現(xiàn) 代 科 技 的 發(fā) 展，發(fā) 酵 尾 氣 分 析 所 采 用 的 各檢測部件本身的響應(yīng)時間非常短，一般在毫秒級， 但從發(fā)酵罐排氣口到檢測腔，尾氣的傳輸需要時間， 相比之下檢測時間 可 忽 略 不 計，故完成一次檢測的 時間主要取決于尾氣的傳輸時間 。
雖然采用一套檢測部件加轉(zhuǎn)換開關(guān)對多 套 發(fā) 酵 設(shè)備分時切換輪巡檢測的方式，可以實現(xiàn)一套尾氣分 析系統(tǒng)測定多點尾氣，降低發(fā) 酵 設(shè) 備 的 平 均 成 本，但 是在切換過程中，氣路轉(zhuǎn)換無 法 瞬 間 完 成，必 須 反 復(fù) 用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣，會造成尾氣 混合帶來檢測誤差，此外還存 在 傳 輸 時 間 長 、信 號 延 時等問題，也增加了 染 菌 風 險 。 因 此，在 進 行 發(fā) 酵 尾 氣分析檢測時，應(yīng) 該 采 用 獨 立 的 單 通 道 檢 測，即一套 檢測設(shè)備連接一個發(fā)酵罐，唯有采用此方式才可以實 現(xiàn)實時連續(xù)在線檢測，捕捉到那些極其重要的臨界點。
4 結(jié) 論
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)可以深入了解細胞的代 謝狀況 。分析曲線上的“臨界點”往往反映了發(fā)酵過 程狀態(tài)的改變，對研究發(fā) 酵工藝至關(guān)重要 。 要 捕 捉 這些臨界點就需要進行實時連續(xù)在線檢測，唯 有 采 用獨立的單通 道檢測方能做到 。 目 前，發(fā) 酵 尾 氣 分 析技術(shù)日臻成熟，尾氣分析裝置也成為發(fā)酵罐的標 準配置 。 隨著設(shè)備的普及和尾氣分析在多方面應(yīng)用 的深入開展，業(yè)界對其應(yīng)用效果的期望愈來愈高，單 通道檢測 在發(fā)酵尾氣分析中 的 意 義 會 日 益 清 晰 明 了，該檢測方式有望被業(yè)界廣泛接受 。
參考文獻：（略）
論單通道檢測在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用
公維麗1，2，劉仲匯1，2，馬耀宏1，2，史建國1，2
(1．齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物研究所，山東 濟南 250014；2．山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)
摘要：發(fā)酵尾氣分析技術(shù)在業(yè)內(nèi)的應(yīng)用已逐漸展開，但人們對單通道檢測的認識依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過程的“實時性”以及發(fā)酵過程的“臨界點”反映發(fā)酵狀態(tài)的改變等方面，闡述了發(fā) 酵尾氣分析應(yīng)采用實時、連續(xù)、在線檢測；通過以尾氣分析獲得的“臨界點”在發(fā)酵工程中的應(yīng)用(指 導轉(zhuǎn)速調(diào)整、流加補料、乳糖誘導及處理異常發(fā)酵)，進一步闡明只有單通道檢測才能真正做到檢測 的實時、連續(xù)、在線，捕捉到有價值的“臨界點”信息。
關(guān)鍵詞：發(fā)酵；尾氣分析；單通道；檢測
中圖分類號：Q819 文獻標志碼：A 文章編號：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas
analysis
GONG Weili1，2， LIU Zhonghui1，2， MA Yaohong1，2， SHI Jianguo1，2
(1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)， Biology Institute，Jinan 250014， China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014， China)
Abstract： The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry，but single－channel detection is still poorly understood．In this paper，we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis，the “real－time”of biological process，and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state，and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment，flow feeding， lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real－time，continuous and online detection，and capture valuable “critical point”information．
Keywords： fermentation； tail gas analysis； single channel； detection
收稿日期：2022－09－01
基金項目：齊魯工業(yè)大學科教產(chǎn)融合試點工程基礎(chǔ)研究類基金資助項目 (2022PY067)；齊魯工業(yè)大學科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專項(2022JBZ01－06)； 山東省重點研發(fā)計劃項目 (重大關(guān)鍵技術(shù))(2016ZDJS07A20)
作者簡介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副研究員，研究方向為生物傳感器技術(shù) 、微生物發(fā)酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。
發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過程中在線檢測尾氣中 的 CO2 和 O2 的體 積 分 數(shù)，計 算 呼 吸 代 謝 參 數(shù) CO2 釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細胞代謝信息，是發(fā)酵工程 的一種過程分析技術(shù)(Process analysis technology， PAT)。 無論 是 在 微 生 物 生 長 階 段，還 是 在 產(chǎn) 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長 狀 態(tài) 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關(guān) 。 OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發(fā)酵 液 的 營 養(yǎng) 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關(guān) 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內(nèi) 代 謝 的 變 化，揭 示 了發(fā)酵過程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長 、能量代謝維持 、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結(jié)果[1－7] 。利用這些參數(shù)及相關(guān)性分 析，可 以 更好地對發(fā)酵過程進行監(jiān)測 、分析，從而深入了解發(fā) 酵規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵 工 藝，控 制 發(fā) 酵 過 程，提 高 發(fā) 酵 產(chǎn) 率和產(chǎn)量，降低成本，加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化 。
與溶解氧和 pH 檢 測 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數(shù) CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發(fā)酵過 程的部分特質(zhì)，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學意義 。尾氣分析時僅采集 發(fā)酵罐排出的尾氣，不 影響發(fā)酵罐 結(jié) 構(gòu)，不 接 觸 發(fā) 酵 液，無 染 菌 風 險[8－10]， 更容易被業(yè)界接受，故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析 手段，已被應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品 等領(lǐng)域 。 雖然該技術(shù)已在業(yè)內(nèi)得到應(yīng)用，但是由于歷 史原因以及設(shè)備成本等因素的影響，對檢測設(shè)備是否 需要采用獨立的單 通 道，認 識 依 舊 模 糊 。 因 此，筆 者 從理論與實際應(yīng)用兩方面對該問題加以分析探討 。
1 發(fā)酵尾氣分析應(yīng)實時連續(xù)在線
在 發(fā) 酵 過 程 中，微 生 物 生 長 一 般 需 要 經(jīng) 歷 遲 緩 期 、對數(shù)生 長 期 、穩(wěn) 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 規(guī) 的 液 態(tài) 好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時至數(shù)天 。在看似較 長的發(fā)酵過程中，發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變 往往發(fā)生在很短 的時間內(nèi)，某些代謝變化可能用時更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過 程 優(yōu) 化》[12] 及 相 關(guān)論 文[13] 中 詳細闡述了生 物 過 程 的 “實 時 性 ”： 1) 從生物 過程發(fā)生的時 間以及 生物技術(shù)發(fā)展特點 來看，對于以活細 胞為主體的細胞 大規(guī)模培養(yǎng)的生 物反應(yīng)過程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調(diào)節(jié)的細胞尺度和工藝控制的反應(yīng)器尺度上發(fā)生 的；2) 可將微 生 物 和 細 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結(jié)合和解離以及共價修飾和降 解) 控制的時間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi)，在基 因表達調(diào)控水平上(誘 導 、轉(zhuǎn) 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 �？疾煳� 生 物 和 細 胞 代 謝 調(diào) 節(jié)，在 以 秒 為 單位的時間尺 度 上 是 合 適 的 。 因 此，作 為 動 態(tài) 觀 測 記錄細胞代謝狀況 的 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 設(shè) 備，應(yīng) 對 排 出 的尾氣進行實時連續(xù)在線檢測，只有這樣，才能準確 捕捉到發(fā)酵過程中代謝的改變 。
2 合理利用發(fā)酵過程中的臨界點
2．1 發(fā)酵過程中的臨界點
李強等[14] 在《微生物發(fā)酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規(guī)律》中，通過青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個體系的發(fā)酵實驗及動力學分析，對 CER 的變化規(guī)律進行了探 究，研 究 結(jié) 果 表 明：無 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發(fā) 酵 、混合菌發(fā) 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態(tài) 變 化 有 著密切聯(lián)系；CER 曲線上的轉(zhuǎn) 折 點 對 應(yīng) 的 就 是 發(fā) 酵 狀態(tài)的轉(zhuǎn)變點 。 由該文獻的 CER 曲線可以發(fā)現(xiàn)：在 這些轉(zhuǎn)折點處曲線發(fā)生了方向性改變，即 由 升 轉(zhuǎn) 為 降，或者由降轉(zhuǎn)為 升，曲線出現(xiàn)明顯的峰或谷，發(fā) 酵 體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變 。
在發(fā)酵過程中還存在另一類極具價值 的 變 化 點，即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速，或由快速 轉(zhuǎn)為緩慢的時間點，比如在微生物生長由遲緩期進 入對數(shù)生長期，由 對數(shù)生長期進入穩(wěn)定期以及由穩(wěn) 定期進入衰亡期的那些時間點上，都有可能出現(xiàn)該 情況 。在這類時間點上，雖然發(fā)酵體系的 CER 曲線 沒有發(fā)生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發(fā)生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說發(fā)生了從一個 發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變到另一個發(fā)酵階段 。這類變化點在發(fā) 酵過程中普遍存在，不僅有著明確的生物學意義，而 且具有非常重要的應(yīng)用價值 �？蓪l(fā)酵過程中這類 變化速率顯著改變 的 點，以及發(fā)生方向性改變的轉(zhuǎn) 折點統(tǒng)稱為臨界變化點，簡稱“臨界點”，其特征是發(fā) 酵體系發(fā)生了從一個狀態(tài)到另一個狀態(tài)的改變，亦 或從一個階段到另一個階段的改變 。
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)進行實時連續(xù) 在 線 監(jiān) 測，可方便 、直觀地獲得發(fā)酵過程中的臨界點 。這些 臨界點提供的豐富信息可以幫助人們辨識發(fā)酵過程 狀態(tài)，為 調(diào) 整 攪 拌 轉(zhuǎn) 速／通 氣 量 、流 加 補 料 、基 因 誘 導，以及異常 發(fā)酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導，同時也為工藝放大提供對比數(shù)據(jù) 。充分重視和 利用這些臨界點信息對優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義 。
2．2 利用發(fā)酵過程臨界點指導操作
2．2．1 利用臨界點調(diào)整供氧
溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長及產(chǎn)物合成所必 需的 。在發(fā)酵過程 中，特 別是在高密度工程菌培養(yǎng) 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。 如何適時調(diào)整攪 拌轉(zhuǎn)速和通氣量以達到最適溶解氧，是 發(fā) 酵 工 藝 的 關(guān)鍵點之一[15－17] 。 一般根據(jù)溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結(jié)果等進行調(diào)整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點，則可以準確把握調(diào)整時機 。
在山東省科學 院 生 物 研 究 所 承 擔 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發(fā)酵智能控制關(guān)鍵技術(shù)”(山東省重點研 發(fā)計劃項目 2016ZDJS07A20) 項 目 中，在 10L 實 驗 室發(fā)酵罐上，采用 FGA 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 儀，對 重 組 畢 赤酵母表達植酸酶過程進行實時在線檢測 。 發(fā)酵溫 度 30 ℃，初 始 發(fā) 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉(zhuǎn)速 200r／min 。 發(fā)酵 6h5min 時，CER 開 始 緩 慢上升；發(fā) 酵 25h26 min 時，CER 出 現(xiàn) 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點，預(yù)示發(fā) 酵進入對數(shù)生長 期，此時 立刻調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速達 530r／min， 并保持至 發(fā) 酵 48h30 min，之 后調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 500r／min，直至 發(fā) 酵 結(jié) 束 。 該 發(fā) 酵 過 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過程中，發(fā) 酵 15h 時 進 行 甲醇誘導，誘 導 5h 后 開 啟 蛋 白 表 達，SDS－PAGE 檢 測植酸酶表達見文獻[18]，最終酶活達 3 000U／mL。
摘要：發(fā)酵尾氣分析技術(shù)在業(yè)內(nèi)的應(yīng)用已逐漸展開，但人們對單通道檢測的認識依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過程的“實時性”以及發(fā)酵過程的“臨界點”反映發(fā)酵狀態(tài)的改變等方面，闡述了發(fā) 酵尾氣分析應(yīng)采用實時、連續(xù)、在線檢測；通過以尾氣分析獲得的“臨界點”在發(fā)酵工程中的應(yīng)用(指 導轉(zhuǎn)速調(diào)整、流加補料、乳糖誘導及處理異常發(fā)酵)，進一步闡明只有單通道檢測才能真正做到檢測 的實時、連續(xù)、在線，捕捉到有價值的“臨界點”信息。
關(guān)鍵詞：發(fā)酵；尾氣分析；單通道；檢測
中圖分類號：Q819 文獻標志碼：A 文章編號：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas
analysis
GONG Weili1，2， LIU Zhonghui1，2， MA Yaohong1，2， SHI Jianguo1，2
(1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)， Biology Institute，Jinan 250014， China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014， China)
Abstract： The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry，but single－channel detection is still poorly understood．In this paper，we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis，the “real－time”of biological process，and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state，and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment，flow feeding， lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real－time，continuous and online detection，and capture valuable “critical point”information．
Keywords： fermentation； tail gas analysis； single channel； detection
收稿日期：2022－09－01
基金項目：齊魯工業(yè)大學科教產(chǎn)融合試點工程基礎(chǔ)研究類基金資助項目 (2022PY067)；齊魯工業(yè)大學科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專項(2022JBZ01－06)； 山東省重點研發(fā)計劃項目 (重大關(guān)鍵技術(shù))(2016ZDJS07A20)
作者簡介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副研究員，研究方向為生物傳感器技術(shù) 、微生物發(fā)酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。
發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過程中在線檢測尾氣中 的 CO2 和 O2 的體 積 分 數(shù)，計 算 呼 吸 代 謝 參 數(shù) CO2 釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細胞代謝信息，是發(fā)酵工程 的一種過程分析技術(shù)(Process analysis technology， PAT)。 無論 是 在 微 生 物 生 長 階 段，還 是 在 產(chǎn) 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長 狀 態(tài) 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關(guān) 。 OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發(fā)酵 液 的 營 養(yǎng) 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關(guān) 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內(nèi) 代 謝 的 變 化，揭 示 了發(fā)酵過程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長 、能量代謝維持 、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結(jié)果[1－7] 。利用這些參數(shù)及相關(guān)性分 析，可 以 更好地對發(fā)酵過程進行監(jiān)測 、分析，從而深入了解發(fā) 酵規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵 工 藝，控 制 發(fā) 酵 過 程，提 高 發(fā) 酵 產(chǎn) 率和產(chǎn)量，降低成本，加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化 。
與溶解氧和 pH 檢 測 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數(shù) CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發(fā)酵過 程的部分特質(zhì)，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學意義 。尾氣分析時僅采集 發(fā)酵罐排出的尾氣，不 影響發(fā)酵罐 結(jié) 構(gòu)，不 接 觸 發(fā) 酵 液，無 染 菌 風 險[8－10]， 更容易被業(yè)界接受，故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析 手段，已被應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品 等領(lǐng)域 。 雖然該技術(shù)已在業(yè)內(nèi)得到應(yīng)用，但是由于歷 史原因以及設(shè)備成本等因素的影響，對檢測設(shè)備是否 需要采用獨立的單 通 道，認 識 依 舊 模 糊 。 因 此，筆 者 從理論與實際應(yīng)用兩方面對該問題加以分析探討 。
1 發(fā)酵尾氣分析應(yīng)實時連續(xù)在線
在 發(fā) 酵 過 程 中，微 生 物 生 長 一 般 需 要 經(jīng) 歷 遲 緩 期 、對數(shù)生 長 期 、穩(wěn) 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 規(guī) 的 液 態(tài) 好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時至數(shù)天 。在看似較 長的發(fā)酵過程中，發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變 往往發(fā)生在很短 的時間內(nèi)，某些代謝變化可能用時更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過 程 優(yōu) 化》[12] 及 相 關(guān)論 文[13] 中 詳細闡述了生 物 過 程 的 “實 時 性 ”： 1) 從生物 過程發(fā)生的時 間以及 生物技術(shù)發(fā)展特點 來看，對于以活細 胞為主體的細胞 大規(guī)模培養(yǎng)的生 物反應(yīng)過程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調(diào)節(jié)的細胞尺度和工藝控制的反應(yīng)器尺度上發(fā)生 的；2) 可將微 生 物 和 細 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結(jié)合和解離以及共價修飾和降 解) 控制的時間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi)，在基 因表達調(diào)控水平上(誘 導 、轉(zhuǎn) 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 �？疾煳� 生 物 和 細 胞 代 謝 調(diào) 節(jié)，在 以 秒 為 單位的時間尺 度 上 是 合 適 的 。 因 此，作 為 動 態(tài) 觀 測 記錄細胞代謝狀況 的 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 設(shè) 備，應(yīng) 對 排 出 的尾氣進行實時連續(xù)在線檢測，只有這樣，才能準確 捕捉到發(fā)酵過程中代謝的改變 。
2 合理利用發(fā)酵過程中的臨界點
2．1 發(fā)酵過程中的臨界點
李強等[14] 在《微生物發(fā)酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規(guī)律》中，通過青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個體系的發(fā)酵實驗及動力學分析，對 CER 的變化規(guī)律進行了探 究，研 究 結(jié) 果 表 明：無 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發(fā) 酵 、混合菌發(fā) 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態(tài) 變 化 有 著密切聯(lián)系；CER 曲線上的轉(zhuǎn) 折 點 對 應(yīng) 的 就 是 發(fā) 酵 狀態(tài)的轉(zhuǎn)變點 。 由該文獻的 CER 曲線可以發(fā)現(xiàn)：在 這些轉(zhuǎn)折點處曲線發(fā)生了方向性改變，即 由 升 轉(zhuǎn) 為 降，或者由降轉(zhuǎn)為 升，曲線出現(xiàn)明顯的峰或谷，發(fā) 酵 體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變 。
在發(fā)酵過程中還存在另一類極具價值 的 變 化 點，即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速，或由快速 轉(zhuǎn)為緩慢的時間點，比如在微生物生長由遲緩期進 入對數(shù)生長期，由 對數(shù)生長期進入穩(wěn)定期以及由穩(wěn) 定期進入衰亡期的那些時間點上，都有可能出現(xiàn)該 情況 。在這類時間點上，雖然發(fā)酵體系的 CER 曲線 沒有發(fā)生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發(fā)生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說發(fā)生了從一個 發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變到另一個發(fā)酵階段 。這類變化點在發(fā) 酵過程中普遍存在，不僅有著明確的生物學意義，而 且具有非常重要的應(yīng)用價值 �？蓪l(fā)酵過程中這類 變化速率顯著改變 的 點，以及發(fā)生方向性改變的轉(zhuǎn) 折點統(tǒng)稱為臨界變化點，簡稱“臨界點”，其特征是發(fā) 酵體系發(fā)生了從一個狀態(tài)到另一個狀態(tài)的改變，亦 或從一個階段到另一個階段的改變 。
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)進行實時連續(xù) 在 線 監(jiān) 測，可方便 、直觀地獲得發(fā)酵過程中的臨界點 。這些 臨界點提供的豐富信息可以幫助人們辨識發(fā)酵過程 狀態(tài)，為 調(diào) 整 攪 拌 轉(zhuǎn) 速／通 氣 量 、流 加 補 料 、基 因 誘 導，以及異常 發(fā)酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導，同時也為工藝放大提供對比數(shù)據(jù) 。充分重視和 利用這些臨界點信息對優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義 。
2．2 利用發(fā)酵過程臨界點指導操作
2．2．1 利用臨界點調(diào)整供氧
溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長及產(chǎn)物合成所必 需的 。在發(fā)酵過程 中，特 別是在高密度工程菌培養(yǎng) 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。 如何適時調(diào)整攪 拌轉(zhuǎn)速和通氣量以達到最適溶解氧，是 發(fā) 酵 工 藝 的 關(guān)鍵點之一[15－17] 。 一般根據(jù)溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結(jié)果等進行調(diào)整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點，則可以準確把握調(diào)整時機 。
在山東省科學 院 生 物 研 究 所 承 擔 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發(fā)酵智能控制關(guān)鍵技術(shù)”(山東省重點研 發(fā)計劃項目 2016ZDJS07A20) 項 目 中，在 10L 實 驗 室發(fā)酵罐上，采用 FGA 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 儀，對 重 組 畢 赤酵母表達植酸酶過程進行實時在線檢測 。 發(fā)酵溫 度 30 ℃，初 始 發(fā) 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉(zhuǎn)速 200r／min 。 發(fā)酵 6h5min 時，CER 開 始 緩 慢上升；發(fā) 酵 25h26 min 時，CER 出 現(xiàn) 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點，預(yù)示發(fā) 酵進入對數(shù)生長 期，此時 立刻調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速達 530r／min， 并保持至 發(fā) 酵 48h30 min，之 后調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 500r／min，直至 發(fā) 酵 結(jié) 束 。 該 發(fā) 酵 過 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過程中，發(fā) 酵 15h 時 進 行 甲醇誘導，誘 導 5h 后 開 啟 蛋 白 表 達，SDS－PAGE 檢 測植酸酶表達見文獻[18]，最終酶活達 3 000U／mL。
由圖 1 可知：在臨界點改變攪拌轉(zhuǎn)速后，細胞快 速進入對數(shù)生長期 。 實驗中根據(jù)臨界點及曲線變化 趨 勢，恰 當 掌握攪拌轉(zhuǎn)速 調(diào) 整時機，滿 足 供 氧 需 求，使植酸酶表達量及酶活均達較高水平 。
2．2．2 利用臨界點進行補料
流加補料－分 批 發(fā) 酵[19－23] 是現(xiàn)代發(fā)酵工 程 普 遍 采用的方式，可以較好地解決底物阻遏，按設(shè)備能力 供氧，減緩代謝有害物的不利影響；尤其對于基因工 程菌高密度發(fā)酵，流加補料是實現(xiàn)高密度發(fā)酵必不 可少的手段 。流加補料技術(shù)的關(guān)鍵是對補料時機的 把握，利用發(fā)酵尾 氣分析曲線中的臨界點能夠比較 精準地掌控補料時機 。
某大型藥企在重 組 大 腸 桿 菌培養(yǎng)白細 胞 介 素－ Ⅱ 生產(chǎn)過程中，在 1t 生產(chǎn)罐上應(yīng)用 FGA 發(fā)酵尾 氣 分析儀，監(jiān)測尾 氣 變 化，其 發(fā) 酵 過 程 CER 曲 線 如 圖 2 所 示 。 由 圖 2 可 以 看 出 CO2 的 整 體 變 化 規(guī) 律： 1) 發(fā)酵開 始 后，CER 先 有 極 短 的 平 緩 區(qū)，很 快 在 1h32min時曲線 出 現(xiàn) 快 速 上 升 的 臨 界 點，預(yù) 示 重 組大腸桿菌生長進入對數(shù)生長期，此時開始流加補 料，并根據(jù) DO反饋值調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，保 持 DO 在 較 高水平 。2) 在 CER迅速上升的對數(shù)生長期，逐漸提 高流加補料速率，在達到峰值，出現(xiàn)臨界點時，流加速 率達到最大 。3) 在 發(fā) 酵 后 期，補 料 速 率 維 持 在 某 一 穩(wěn)定水平，直至發(fā)酵結(jié) 束 。整 個 發(fā) 酵 過 程 約 10h，產(chǎn) 物表達量 占 菌 體 總 蛋 白 的 40％ 。 發(fā) 酵 過 程 中 對 數(shù) 生長期起點和終點(臨界 點) 的 出 現(xiàn) 都 發(fā) 生 在 1 min 內(nèi)，如非采用實時連續(xù)在線檢測是難以觀察到的 。
2．3 利用臨界點進行誘導
在重組大 腸 桿 菌 發(fā) 酵 過 程 中，通 常 采 用 IPTG 誘導劑進 行 誘 導 。 IPTG 誘 導 劑 具 有 一 定 毒 性，對宿主和代謝產(chǎn)物有抑制作用，且 費 用 高 昂，在 工 業(yè) 化 大規(guī)模生產(chǎn)中較難推廣 。乳糖是一種廉價資源，可以 作為碳源被大腸桿菌代謝利用，有報道在重組蛋白培養(yǎng)中用其作誘導劑，但尚不普遍，究其原因，除誘導機 理復(fù)雜外，乳糖誘導時機不易把握也是重要因素 。
張毅 等[24] 在 LB 培 養(yǎng) 基 中，分 別 在 對 數(shù) 生 長 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 對 融 合 蛋 白 表 達 菌 BL21 (DE3)(pFu) 進行 乳 糖 誘 導，發(fā) 現(xiàn)：乳糖的加入會造 成菌體生長遲滯，在 早 期 、中 期 進 行誘導均不理想， 只有在后期進行誘 導 效 果 最 佳，此 時既可以得到較 高的表達產(chǎn)物，又可以獲得較高 的 菌 體 密度 。 有 研 究報道[22－30] 表明：在培養(yǎng)基葡萄糖剛剛耗盡，細胞濃 度增加緩慢或略有下降時開始誘導，效果最佳 。
應(yīng) 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，可 以 直 觀 地 辨 識 菌 體 生長的各個階 段 。 一般在對 數(shù)生長期的后期，即 培 養(yǎng)基中葡萄糖剛剛 耗 盡，細胞濃度增加緩慢或略有 下降時，尾氣分析的 CER 曲線會出現(xiàn)一個由上升轉(zhuǎn) 為下降的臨界點，利用該臨界點可 以方便地確定誘 導時機，及時進行乳糖誘導 。
2．2．4 利用臨界點處理異常發(fā)酵
雖然微生物發(fā)酵是一個非線性時變系統(tǒng)，包含了 生物、化學及物理的各種變化，過程較為復(fù)雜，但是當 各 種 條 件 固 定 后，微 生 物 細 胞 代 謝 又 遵 循 一 定 的 規(guī) 律 。從發(fā)酵尾氣分析得到的大量數(shù)據(jù)來看，在某種發(fā) 酵體系中，當工藝條件確定后，其 分析曲線整體形態(tài) 是確定的，一旦發(fā)生改變，通常 預(yù) 示著某種代謝的改 變 。 因此，捕捉那些異 常 臨 界 點，對異常發(fā)酵的及早 發(fā)現(xiàn)和處理很有意義，特別是對工業(yè)大生產(chǎn)和高附加 值的生物制藥更是如此 。就此而言，尾氣分析的敏感 性和實用性均超過了 pH 、DO等其他現(xiàn)有檢測手段 。
在廣東某高校進行的重組大腸桿菌發(fā)酵 藥 物 蛋 白實驗中，發(fā)酵開始后，經(jīng)過短暫的遲緩期，CO2 曲線 開始緩慢上 升，約 2h 后 發(fā) 酵 快 速 進 入 對 數(shù) 生 長 期； 20min后，CO2 曲 線 突 然 出 現(xiàn) 了 下 折，CO2 體積分數(shù) 迅速下降，在不到 30min 的時間內(nèi)下降到接種前水平， 鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)此時發(fā)酵液中的工程菌已經(jīng)消失，判斷 感染了噬菌體，隨即停止發(fā)酵，并迅速進行滅菌處理。 該實驗過程的 CO2 體積分數(shù)變化曲線如圖 3 所示。
3 實時連續(xù)在線檢測
3．1 實時連續(xù)在線檢測的意義
利 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，特 別 是 利 用 分 析 曲 線 上的臨界點，監(jiān)測發(fā)酵過程中細胞的代謝變化，可以 為發(fā)酵操作及進一步工藝優(yōu)化提供 依 據(jù) 。 發(fā)酵尾氣 分析技術(shù)的關(guān)鍵在于對發(fā)酵過程中尾氣的 CO2 及 O2 進行實時連續(xù)在線監(jiān)測，只有這樣才能捕捉到發(fā)酵狀 態(tài)改變的臨界點，監(jiān)測到細胞代謝狀態(tài)的改變 。 由于 發(fā)酵過程中臨界點的出現(xiàn)和狀態(tài)的改變往往 發(fā) 生 在 極短的時間內(nèi)，所以實時連續(xù)在線檢測尤為重要 。
3．2 采用單通道確保實時連續(xù)在線檢測
隨 著 現(xiàn) 代 科 技 的 發(fā) 展，發(fā) 酵 尾 氣 分 析 所 采 用 的 各檢測部件本身的響應(yīng)時間非常短，一般在毫秒級， 但從發(fā)酵罐排氣口到檢測腔，尾氣的傳輸需要時間， 相比之下檢測時間 可 忽 略 不 計，故完成一次檢測的 時間主要取決于尾氣的傳輸時間 。
雖然采用一套檢測部件加轉(zhuǎn)換開關(guān)對多 套 發(fā) 酵 設(shè)備分時切換輪巡檢測的方式，可以實現(xiàn)一套尾氣分 析系統(tǒng)測定多點尾氣，降低發(fā) 酵 設(shè) 備 的 平 均 成 本，但 是在切換過程中，氣路轉(zhuǎn)換無 法 瞬 間 完 成，必 須 反 復(fù) 用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣，會造成尾氣 混合帶來檢測誤差，此外還存 在 傳 輸 時 間 長 、信 號 延 時等問題，也增加了 染 菌 風 險 。 因 此，在 進 行 發(fā) 酵 尾 氣分析檢測時，應(yīng) 該 采 用 獨 立 的 單 通 道 檢 測，即一套 檢測設(shè)備連接一個發(fā)酵罐，唯有采用此方式才可以實 現(xiàn)實時連續(xù)在線檢測，捕捉到那些極其重要的臨界點。
4 結(jié) 論
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)可以深入了解細胞的代 謝狀況 。分析曲線上的“臨界點”往往反映了發(fā)酵過 程狀態(tài)的改變，對研究發(fā) 酵工藝至關(guān)重要 。 要 捕 捉 這些臨界點就需要進行實時連續(xù)在線檢測，唯 有 采 用獨立的單通 道檢測方能做到 。 目 前，發(fā) 酵 尾 氣 分 析技術(shù)日臻成熟，尾氣分析裝置也成為發(fā)酵罐的標 準配置 。 隨著設(shè)備的普及和尾氣分析在多方面應(yīng)用 的深入開展，業(yè)界對其應(yīng)用效果的期望愈來愈高，單 通道檢測 在發(fā)酵尾氣分析中 的 意 義 會 日 益 清 晰 明 了，該檢測方式有望被業(yè)界廣泛接受 。
參考文獻：（略）
標簽：
發(fā)酵尾氣分析
在線檢測
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