當(dāng)牙周炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞被募集并極化為M1促炎表型。這些長(zhǎng)期活動(dòng)的M1巨噬細(xì)胞隨后產(chǎn)生高水平的NO、活性氧和促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子可促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生RANKL的受體激活劑，導(dǎo)致破骨細(xì)胞過(guò)度形成，從而破壞骨穩(wěn)態(tài)。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力而被廣泛用于各種炎癥性疾病的治療，包括牙周炎。越來(lái)越多的證據(jù)表明，MSCs的治療效果主要?dú)w因于其分泌的旁分泌因子，其中最關(guān)鍵的是細(xì)胞外囊泡（EV），包括外泌體（EXO）、小細(xì)胞外囊泡（sEV）。有研究表明，MSC-sEV在免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)組織修復(fù)再生等治療效果上與MSC類似，且在安全性、存儲(chǔ)和給藥方面比MSC療法更具優(yōu)勢(shì)，因此被認(rèn)為是一種大有潛力的治療方法。

牙髓干細(xì)胞（DPSCs）是從成人牙髓中分離出來(lái)的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，其容易獲得，且不會(huì)引起任何倫理問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，牙髓干細(xì)胞來(lái)源小細(xì)胞外囊泡（DPSC-sEV)顯示出比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源小細(xì)胞外囊泡（BMSC-sEV）更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。不過(guò)，DPSC-sEV能否直接抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的生成，目前還是一個(gè)未知數(shù)。此外，體外培養(yǎng)的MSCs通常暴露在常氧（21% O₂）條件下，而體內(nèi)相當(dāng)一部分MSCs存在于低氧環(huán)境中（2%-8%），那么在低氧條件下產(chǎn)生的DPSC-sEV是否能發(fā)揮更好的治療效果？

為此，中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)的DPSC-sEV通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和破骨細(xì)胞生成來(lái)改善炎癥性骨溶解。這項(xiàng)成果于近日發(fā)表在《Bioactive Materials》雜志上，有望為骨髓炎、牙周炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等常見病的治療帶來(lái)一種新策略。
 

研究材料與方法
研究人員從SD大鼠上頜中切牙的牙髓中分離出DPSCs，并鑒定了DPSCs的成骨分化和成脂分化能力（OriCell^®MSC成脂誘導(dǎo)分化試劑盒、OriCell^®茜素紅染色液、OriCell^®油紅O染色液等產(chǎn)品為該項(xiàng)研究助力）。

之后，研究人員從DPSCs中分離出小細(xì)胞外囊泡（sEV），并開展了一系列的分析。在體內(nèi)研究中，使用了LPS誘導(dǎo)的小鼠顱骨炎性骨吸收模型，體外研究則使用了RAW264.7巨噬細(xì)胞。

技術(shù)路線
從DPSCs中分離出sEV，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)了DPSCs的sEV釋放
Hypo-sEV誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成，從而改善了LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收
通過(guò)miRNA表達(dá)譜分析等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導(dǎo)的
miR-210-3p通過(guò)抑制NF-κB1 p105表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的形成

研究結(jié)果
01 Hypo-sEV促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成
在分離出DPSCs后，研究人員經(jīng)過(guò)流式分析和免疫熒光分析，確認(rèn)培養(yǎng)的DPSCs具有MSC的間質(zhì)表型，并具備多潛能分化能力。隨后，他們通過(guò)超速離心法從常氧（normoxic conditions）和低氧(hypoxic conditions)條件下培養(yǎng)的DPSCs上清液中分離出sEV，分別命名為Nor-sEV和Hypo-sEV。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種sEV都表現(xiàn)出典型的EV特征，但Hypo-sEV的濃度更高，且蛋白質(zhì)濃度也明顯更高。而且，通過(guò)sEV蛋白標(biāo)志物分析，發(fā)現(xiàn)低氧明顯增加誘導(dǎo)了DPSCs釋放sEV。

為了比較這兩種sEV對(duì)炎癥性骨溶解的治療效果，研究人員使用了LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性骨吸收模型。通過(guò)micro-CT掃描和組織學(xué)檢查評(píng)估，他們發(fā)現(xiàn)Nor-sEV對(duì)LPS誘導(dǎo)的骨溶解未能表現(xiàn)出明顯的治療效果。相反，Hypo-sEV挽救了小鼠顱骨基質(zhì)的炎癥性骨溶解，即提高了BV/TV值，并減少了骨侵蝕面積（圖1）。這些結(jié)果表明，Hypo-sEV明顯改善了LPS誘導(dǎo)的體內(nèi)炎癥性骨吸收。
 

Hypo-sEV在體內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收^[1]

由于巨噬細(xì)胞從M1到M2的表型轉(zhuǎn)變可促進(jìn)骨修復(fù)，故研究人員接著分析了Hypo-sEV是否可促進(jìn)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞M2極化。LPS導(dǎo)致CD68⁺iNOS⁺巨噬細(xì)胞（M1表型）數(shù)量增加，但Hypo-sEV和Nor-sEV的加入使得顱骨基質(zhì)中出現(xiàn)了更多的CD68⁺Arg1⁺巨噬細(xì)胞（M2表型），且Hypo-sEV處理后的M1巨噬細(xì)胞更少，M2巨噬細(xì)胞更多。與Nor-sEV相比，Hypo-sEV明顯抑制IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)IL-10和Arg1的表達(dá)。由此可見，Hypo-sEV可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。

炎癥性骨吸收是由破骨細(xì)胞的過(guò)度生成引起的，因此研究人員還研究了Hypo-sEV是否能抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞的生成。他們發(fā)現(xiàn)，Nor-sEV和Hypo-sEV都減少了LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞（TRAP陽(yáng)性）數(shù)量，且Hypo-sEV組的破骨細(xì)胞數(shù)量低于Nor-sEV組。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也表明，這兩種sEV抑制了RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，且Hypo-sEV組的抑制效果優(yōu)于Nor-sEV組。這些數(shù)據(jù)顯示，Hypo-sEV在體內(nèi)和體外直接抑制了破骨細(xì)胞生成。

02 Hypo-sEV通過(guò)上調(diào)miR-210-3p表達(dá)而發(fā)揮作用
為了進(jìn)一步分析這背后的分子機(jī)制，研究人員決定從miRNA研究入手。他們利用新一代測(cè)序分析了Nor-sEV和Hypo-sEV的miRNA表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Nor-sEV相比，Hypo-sEV中有45個(gè)miRNA上調(diào)，64個(gè)miRNA下調(diào)。在重點(diǎn)關(guān)注與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)或破骨細(xì)胞分化有關(guān)的miRNA后，他們還發(fā)現(xiàn)Hypo-sEV中的miR-7578、miR-187-3p和miR-210-3p水平相對(duì)于Nor-sEV升高。后續(xù)分析顯示，miR-210-3p在介導(dǎo)Hypo-sEV的治療效果方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

接著，通過(guò)對(duì)RAW264.7細(xì)胞與兩種sEV的共培養(yǎng)分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了Hypo-sEV可以將miR-210-3p遞送到巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞中。miR-210-3p抑制劑提高了促炎細(xì)胞因子和iNOS的表達(dá)，同時(shí)降低了IL-10和Arg1的表達(dá)，減弱了Hypo-sEV誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化的能力。此外，miR-210-3p抑制劑也部分降低了Hypo-sEV抑制破骨細(xì)胞形成的能力以及破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)（圖2）。這些結(jié)果表明，Hypo-sEV通過(guò)上調(diào)miR-210-3p表達(dá)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成。
 

Hypo-sEV在體外通過(guò)遞送miR-210-3p而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成^[1]

之后，實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移到小鼠模型上繼續(xù)進(jìn)行。為了進(jìn)一步確認(rèn)Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導(dǎo)的，研究人員在LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收模型中使用了miRNA抑制劑antagomir-210-3p。結(jié)果顯示，antagomir-210-3p明顯消除了Hypo-sEV的治療作用。而且與對(duì)照相比，antagomir-210-3p的加入導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞增加，M2型巨噬細(xì)胞減少。這些結(jié)果證實(shí)。miR-210-3p通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化和抑制破骨細(xì)胞生成而明顯改善了LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨溶解。

后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn)，miR-210-3p直接靶向了NF-κB1的3′UTR，而NF-κB通路的激活對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化和破骨細(xì)胞生成至關(guān)重要。miR-210-3p通過(guò)抑制NF-κB1 p105表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的形成。

結(jié)論

miR-210-3p抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收的示意圖^[1]

這項(xiàng)研究表明，低氧預(yù)處理不僅誘導(dǎo)了DPSC-sEV的分泌，還增強(qiáng)了DPSC-sEV介導(dǎo)的對(duì)LPS誘導(dǎo)的骨溶解的治療效果。其中，miR-210-3p通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化和抑制破骨細(xì)胞生成來(lái)保護(hù)骨骼。

因此，低氧誘導(dǎo)的DPSC-sEV和miR-210-3p的這種“一石二鳥”作用有助于開發(fā)新策略來(lái)治療炎癥性或感染性骨溶解。

原文檢索
[1]Jun Tian, Weiyang Chen, Yuhua Xiong, et al. Small extracellular vesicles derived from hypoxic preconditioned dental pulp stem cells ameliorate inflammatory osteolysis by modulating macrophage polarization and osteoclastogenesis. Bioactive Materials, Volume 22, 2023, Pages 326-342, ISSN 2452-199X. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.10.001.