熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)（Fluorescence recovery after photobleaching，簡(jiǎn)稱FRAP），是一種獲取微米尺度上分子擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)信息的熒光成像技術(shù)。¹生物分子功能的實(shí)現(xiàn)與其遷移行為密切相關(guān)，F(xiàn)RAP技術(shù)的出現(xiàn)為研究高度動(dòng)態(tài)的生命體系中分子的擴(kuò)散、互作等提供了方便。²這一技術(shù)是由上個(gè)世紀(jì)70年代被Axelrod和Peter等人提出，目前已成為定量獲取細(xì)胞膜或者亞細(xì)胞器上的生物分子時(shí)空信息的重要工具。

熒光漂白是典型的光化學(xué)過(guò)程，然而FRAP技術(shù)在化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用目前相對(duì)較少。事實(shí)上，熒光漂白，往往被化學(xué)工作者視為一種不太好的現(xiàn)象。筆者希望通過(guò)一些應(yīng)用實(shí)例展示這一技術(shù)在化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的價(jià)值，也讓生命科學(xué)領(lǐng)域的研究人員一瞥化學(xué)FRAP過(guò)程的特點(diǎn)。

什么是FRAP？

FRAP的基本原理如圖1所示。對(duì)于一熒光分子均勻標(biāo)記的薄膜（圖1a,e），某一時(shí)刻用一束高功率密度的激光漂白掉某一個(gè)微區(qū)的熒光分子（t=0, 圖1b,f）。由于分子的擴(kuò)散，微區(qū)外未被漂白的熒光分子將和微區(qū)內(nèi)的熒光分子發(fā)生交換，于是漂白區(qū)域的熒光強(qiáng)度將會(huì)逐漸恢復(fù)（圖1c,g和d,h）。

如果漂白區(qū)域內(nèi)的分子都是流動(dòng)的，那么其熒光強(qiáng)度將恢復(fù)到初始水平（前提是漂白區(qū)域遠(yuǎn)小于整個(gè)熒光薄膜）。如果不能完全恢復(fù)，則預(yù)示著漂白區(qū)域內(nèi)有不能自由移動(dòng)的分子。選取適合的分子擴(kuò)散模型，對(duì)熒光恢復(fù)曲線（圖1i）進(jìn)行擬合，就可以獲得目標(biāo)蛋白的擴(kuò)散系數(shù)或者擴(kuò)散速率。

FRAP技術(shù)發(fā)展概覽

FRAP技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)70年代，學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為Axelrod和Peter是這一技術(shù)的發(fā)明人。¹事實(shí)上，在Axelrod和Peter之前，Liebman和Mu-Ming Poo等人，已經(jīng)發(fā)展出基于光吸收的漂白恢復(fù)技術(shù)，或許可以叫做“吸收漂白后恢復(fù)（Absorbance recovery after photobleaching）”，用以研究視紫紅質(zhì)蛋白在視桿細(xì)胞的外節(jié)膜中的定向遷移。
在Axelrod和Peter的研究中^3-4，他們使用一束高功率密度的激光漂白掉細(xì)胞膜上某一個(gè)微區(qū)內(nèi)的熒光分子，然后將同一束激光用減光片減弱后激發(fā)熒光，并用光電倍增管記錄該區(qū)域的熒光強(qiáng)度，從而獲得生物分子擴(kuò)散的信息。^5-7這些實(shí)驗(yàn)并未使用掃描式的激光照明，因此獲得的主要是時(shí)間維度的分子擴(kuò)散信息。80年代開始，相機(jī)的使用使得不僅可以觀測(cè)到時(shí)間維度的熒光恢復(fù)過(guò)程，還可以在空間上觀測(cè)到FRAP過(guò)程中的分子擴(kuò)散信息。
90年代激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscopy，簡(jiǎn)稱LSCM）的迅猛發(fā)展促進(jìn)了FRAP技術(shù)的快速發(fā)展。在此之前，進(jìn)行FRAP實(shí)驗(yàn)需要自行搭建儀器裝置，LSCM的出現(xiàn)讓FRAP技術(shù)得到了迅速普及。⁸早期的共聚焦FRAP實(shí)驗(yàn)，先用激光漂白掉某一區(qū)域的熒光，然后同樣使用減光片，通過(guò)移動(dòng)激光或者樣品，獲得FRAP過(guò)程中的分子擴(kuò)散的時(shí)空信息。但直到聲光調(diào)制器（Acousto-optical modulator，簡(jiǎn)稱AOM）和聲光可調(diào)諧濾波器（Acousto-optical tunable filter，簡(jiǎn)稱AOTF）的使用，結(jié)合LSCM顯微鏡激光逐個(gè)像素進(jìn)行掃描（每個(gè)像素停留的時(shí)間通常是微秒）的優(yōu)勢(shì)，才使得共聚焦FRAP漂白任意形狀區(qū)域的熒光成為了可能，比如研究高爾基體上相關(guān)的蛋白的遷移。¹相比于單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)激發(fā)體積更小，因此雙光子FRAP技術(shù)也被發(fā)展出來(lái)，該技術(shù)在樣本的體相漂白中優(yōu)勢(shì)明顯。⁹
共聚焦技術(shù)的快速商業(yè)化，使得在共聚焦顯微鏡上實(shí)現(xiàn)FRAP功能成為首選，⁸但價(jià)格相對(duì)便宜的寬場(chǎng)FRAP技術(shù)也被廣泛使用。寬場(chǎng)FRAP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于易于實(shí)現(xiàn)漂白過(guò)程中整個(gè)樣本的快速熒光成像，這對(duì)于共聚焦系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是較難實(shí)現(xiàn)的。寬場(chǎng)FRAP技術(shù)在實(shí)現(xiàn)方式上與共聚焦FRAP略有不同：光漂白是借助掃描振鏡快速移動(dòng)高度匯聚的激光束（焦點(diǎn)處光斑尺寸~1微米）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，寬場(chǎng)成像則可以使用常規(guī)的汞燈照明或者全內(nèi)反射激發(fā)實(shí)現(xiàn)（Total internal reflection microscopy，簡(jiǎn)稱TIRF）。這意味著普通的倒置熒光顯微鏡，只需購(gòu)置FRAP模塊，即可實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)FRAP功能，降低了成本。
另外，TIRF顯微鏡高的z軸分辨率（~200 nm），搭配FRAP模塊，特別適合研究細(xì)胞膜表面蛋白分子的擴(kuò)散行為。比如商業(yè)化TIRF-cellFRAP系統(tǒng)（圖2），結(jié)合實(shí)時(shí)控制器（Real time controller，簡(jiǎn)稱RTC）和計(jì)算器控制軟件Cellsens，可以根據(jù)用戶需實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)漂白任意形狀的區(qū)域，獲得細(xì)胞膜表面的分子擴(kuò)散信息。

圖2 奧林巴斯寬場(chǎng)TIRF-cellFRAP系統(tǒng)

FRAP技術(shù)目前已經(jīng)衍生出多種實(shí)驗(yàn)方案。

• 如果重復(fù)漂白某微小的區(qū)域，那么與該區(qū)域相連的區(qū)域熒光強(qiáng)度將會(huì)逐漸降低，非連通區(qū)域?qū)��?huì)凸顯出來(lái)（熒光強(qiáng)度更亮），這一技術(shù)稱為FLIP（即fluorescence loss in photobleaching）。
• 而若將微區(qū)以外的區(qū)域的熒光全部漂白掉，而觀測(cè)微區(qū)以內(nèi)熒光逐漸變暗的過(guò)程，稱為iFRAP（即inverted FRAP）。
• 光激活顯微成像技術(shù)（Photoactivation），也被稱為FLAP（即fluorescence loss in after photoactivation）。

FLAP技術(shù)基于特定的光轉(zhuǎn)換分子，在強(qiáng)激光刺激下，這些分子展現(xiàn)出激發(fā)波長(zhǎng)或者發(fā)射波長(zhǎng)的變化，從而使得刺激光照射的區(qū)域熒光信號(hào)被點(diǎn)亮，隨著分子的擴(kuò)散，該區(qū)域熒光強(qiáng)度逐漸下降（如圖3所示，表觀上和iFRAP相同）。FLAP的優(yōu)勢(shì)在于刺激區(qū)域以外的地方無(wú)熒光背景，只觀測(cè)被光激活的分子的動(dòng)力學(xué)。這在生物學(xué)研究中極其有用，譬如在自噬研究中，如果熒光激活自噬小體上的蛋白（被光激活熒光蛋白標(biāo)記），就可以觀測(cè)到自噬小體與溶酶體融合的過(guò)程，而之后產(chǎn)生的自噬小體蛋白因未被光激活就不會(huì)產(chǎn)生熒光干擾，就可以獲得自噬小體的壽命（半衰期~25min），這是傳統(tǒng)的FRAP技術(shù)難以做到的。¹¹

圖3 FRAP過(guò)程（a）和FLAP過(guò)程（b）對(duì)比

FRAP技術(shù)在化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的最新的應(yīng)用實(shí)例

用FRAP顯微鏡研究一些人工分子膜體系，其方法與研究細(xì)胞膜表面膜蛋白的遷移類似，在此不再贅述。

下面重點(diǎn)介紹幾個(gè)比較新的實(shí)例——利用FRAP顯微鏡研究復(fù)雜的光化學(xué)和光物理過(guò)程。這些體系盡管同樣表現(xiàn)出FRAP行為，但卻不是分子物種的擴(kuò)散引起，其本質(zhì)是化學(xué)反應(yīng)或者光物理過(guò)程。這些應(yīng)用充分展現(xiàn)了FRAP技術(shù)在化學(xué)和材料科學(xué)研究中的價(jià)值。

• 雙光子FRAP顯微鏡研究鈣鈦礦材料的自修復(fù)行為⁹

鈣鈦礦材料（結(jié)構(gòu)通式ABX3）因其獨(dú)特的光電性質(zhì)，近年來(lái)在太陽(yáng)能電池領(lǐng)域引起廣泛的研究興趣。經(jīng)過(guò)近幾年的發(fā)展，鈣鈦礦太陽(yáng)能電池的光電轉(zhuǎn)換效率迅速突破了20%，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。另一方面，與其它半導(dǎo)體材料顯著不同的是，鈣鈦礦材料在光、熱或者潮濕的條件下不穩(wěn)定，影響太陽(yáng)能電池的效率，因而其穩(wěn)定性問(wèn)題也備受關(guān)注。有意思的是，近期發(fā)現(xiàn)，鈣鈦礦材料具有自修復(fù)特性，比如光照引起的結(jié)構(gòu)損傷，在黑暗條件下會(huì)逐漸恢復(fù)。這衍生出一個(gè)科學(xué)問(wèn)題：鈣鈦礦材料的自修復(fù)行為，與其接觸的界面或環(huán)境有關(guān)，還是材料的本征（體相）屬性呢？
2018年，以色列魏茨曼科學(xué)研究所Ceratti等人，使用共聚焦顯微鏡上搭配的雙光子FRAP裝置回答了這一問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)這是APbBr3（X=MA（甲胺），F(xiàn)A（甲脒），Cs+）鈣鈦礦的本征屬性，且自修復(fù)的速度與A位陽(yáng)離子的種類密切相關(guān)。在研究中，他們利用雙光子激發(fā)照明體積小的優(yōu)點(diǎn)，用波長(zhǎng)為800 nm的激光照射了距離鈣鈦礦單晶表面110 mm處的體相區(qū)域（光刺激破壞材料結(jié)構(gòu)，令A(yù)PbBr3分解成ABr，Pb(0)，Br2，ABr3等），發(fā)現(xiàn)APbBr3表現(xiàn)出FRAP行為，證明了鈣鈦礦自修復(fù)是其本征屬性（如圖4所示），而與表界面或者水、空氣等無(wú)關(guān)。有趣的是，與生物膜相關(guān)的FRAP實(shí)驗(yàn)相比，鈣鈦礦自修復(fù)過(guò)程表現(xiàn)出更長(zhǎng)的熒光恢復(fù)時(shí)間（幾十分鐘）。

圖4 雙光子FRAP研究鈣鈦礦單晶的自修復(fù)行為

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，A位陽(yáng)離子顯著影響鈣鈦礦單晶的自修復(fù)行為：FAPbBr3的自修復(fù)速率最快，MAPbBr3次之，而CsPbBr3自修復(fù)速率最慢（圖5）。這一結(jié)果與鈣鈦礦領(lǐng)域的共識(shí)相悖——全無(wú)機(jī)CsPbBr3鈣鈦礦比有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化鈣鈦礦具有更高的化學(xué)穩(wěn)定性。作者提出，不同陽(yáng)離子的鈣鈦礦分解，盡管產(chǎn)生相似的中間體，但中間體的物理化學(xué)性質(zhì)不同，MAPbBr3和FAPbBr3分解產(chǎn)生的ABr3物種是氣體，易于與分解產(chǎn)生的Pb(0)物種重新結(jié)合形成APbBr3結(jié)構(gòu)，而CsBr3是固體，因而自修復(fù)速度最慢。作者進(jìn)一步研究了漂白功率對(duì)鈣鈦礦材料的自修復(fù)行為的影響，發(fā)現(xiàn)總體上還是FAPbBr3自修復(fù)速率最快，而且漂白功率越大材料自修復(fù)的時(shí)間越長(zhǎng)（可達(dá)數(shù)小時(shí)），但是漂白功率過(guò)大材料將無(wú)法修復(fù)（圖5）。更為有趣的是，MAPbBr3在低的漂白功率下會(huì)表現(xiàn)出光致亮化現(xiàn)象（LP8%，圖5），作者推斷可能是低功率激光照射產(chǎn)生了一些有利于發(fā)光的淺缺陷或者提高了材料的結(jié)晶度所致。

圖5 激光漂白功率和陽(yáng)離子種類對(duì)APbBr3自修復(fù)速率的影響（LP是相對(duì)激光功率，左側(cè)為鈣鈦礦的晶胞結(jié)構(gòu)及MA和FA的化學(xué)結(jié)構(gòu)）。虛線框表示熒光完全恢復(fù)，點(diǎn)框表示熒光僅部分恢復(fù)。每個(gè)小方格對(duì)應(yīng)的鈣鈦礦單晶區(qū)域的尺寸為24.8´19 mm

• 利用FRAP技術(shù)研究單個(gè)有機(jī)分子晶體當(dāng)中的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)¹²

溶液相或者氣相中的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)物分子彼此間相隔較遠(yuǎn)，因此表現(xiàn)出一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即產(chǎn)物濃度呈現(xiàn)指數(shù)型變化。固相反應(yīng)中，反應(yīng)物或者產(chǎn)物之間距離較近，可能呈現(xiàn)顯著的協(xié)同效應(yīng)，那么固相下的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)到底會(huì)呈現(xiàn)什么規(guī)律呢？
2020年，加州大學(xué)河濱分校Christopher J. Bardeen課題組，使用FRAP顯微鏡測(cè)量單個(gè)有機(jī)分子晶體——4-甲基-9羧基蒽（4-fluoro-9-anthracenecarboxylic acid，4F-9AC）的光化學(xué)二聚產(chǎn)物在室溫下的固相熱分解動(dòng)力學(xué)。由于4F-9AC呈現(xiàn)出激基締合物熒光（excimer，Ex=405 nm, Em=510 nm），而4F-9AC二聚物不具有excimer熒光，Christopher J. Bardeen使用自行搭建的FRAP顯微鏡研究了4F-9AC二聚物分子的固相熱分解過(guò)程（刺激激光和探測(cè)激光均為405 nm，但后者的功率密度是前者的1%）。他們利用刺激激光去誘導(dǎo)4F-9AC二聚物分子的形成，而用探測(cè)激光觀測(cè)其熱分解動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)該過(guò)程表現(xiàn)出FRAP行為（圖6a）。有趣的是，該FRAP過(guò)程在高的刺激功率下呈現(xiàn)出S型動(dòng)力學(xué)，而非通常的FRAP實(shí)驗(yàn)中指數(shù)或者近指數(shù)的熒光恢復(fù)過(guò)程，顯著偏離了一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（圖6b）。這暗示高濃度的4F-9AC二聚物分子時(shí)該熱分解過(guò)程被抑制，也就是說(shuō)4F-9AC二聚物彼此之間存在相互作用。作者認(rèn)為，這是由于高濃度4F-9AC二聚物分子時(shí)彼此間的氫鍵作用阻礙二聚物的解聚所致，而低濃度時(shí)二聚物與4F-9AC之間的氫鍵在熱力學(xué)反而有利于熱分解過(guò)程（圖6c）。

圖6 利用FRAP顯微鏡研究4F-9AC二聚物分子的固相熱分解過(guò)程。（a）FRAP過(guò)程和其對(duì)應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)。（b）刺激功率對(duì)FRAP動(dòng)力學(xué)的影響。（c）4F-9AC分子之間通過(guò)羧基形成氫鍵的示意圖
更有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)該FRAP動(dòng)力學(xué)不僅與刺激光的功率密度有關(guān)，還與探測(cè)光的照射方式有關(guān)（功率不變，連續(xù)或者間歇照射）：在低的刺激功率下，探測(cè)光連續(xù)或者間歇照射，其FRAP動(dòng)力學(xué)是一致的；但是高的刺激功率下，探測(cè)光如果連續(xù)照射，4F-9AC二聚物分子僅部分分解，而間斷性照射則完全分解（圖7ai）。同次實(shí)驗(yàn)中，探測(cè)光先連續(xù)照射再間歇式照射，也可以觀測(cè)到這種差別（圖7aii）。為什么探測(cè)光照明方式不同會(huì)造成這種差異呢？仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，低功率探測(cè)光持續(xù)照射下，未經(jīng)刺激光照射的樣本，1h后會(huì)最終達(dá)到和刺激光照射的樣品一樣的熒光強(qiáng)度（圖7b）�？紤]到樣品未被光損傷，且刺激光照射后黑暗條件下4F-9AC二聚物分子會(huì)熱分解完全。這意味著弱功率密度的探測(cè)光照射，會(huì)形成4F-9AC二聚物分子（盡管動(dòng)力學(xué)較慢），最終達(dá)到穩(wěn)態(tài)，而強(qiáng)刺激光照射之后再弱探測(cè)照射，會(huì)讓有機(jī)分子晶體更快的到達(dá)穩(wěn)態(tài)。也就是說(shuō)，借助兩束激光，可以方便的調(diào)控不穩(wěn)定物種——4F-9AC二聚物分子的濃度。 圖7 探測(cè)光的照射方式對(duì)4F-9AC二聚物分子的固相熱分解過(guò)程的影響。(a)兩種刺激功率和不同的探測(cè)光照射方式下的FRAP過(guò)程（i和ii分別為同一樣品的不同次和同次實(shí)驗(yàn)，紅色代表高的刺激激光功率，點(diǎn)代表間歇式探測(cè)光照射）。（b）低功率探測(cè)激光持續(xù)照射下，樣本未經(jīng)刺激光照射和照射后的熒光動(dòng)力學(xué)曲線（紅色代表未經(jīng)刺激激光照射）

• 研究二維過(guò)渡金屬硫族化合物的光物理機(jī)制¹³

上面兩個(gè)例子展示了FRAP技術(shù)在研究光化學(xué)反應(yīng)中的價(jià)值。2021年，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院王偉教授課題組和徐偉高教授課題組合作，首次利用FRAP顯微鏡研究了材料的光物理過(guò)程：實(shí)現(xiàn)了對(duì)二維過(guò)渡金屬硫族化合物單層（transition metal dichalcogenide monolayers，1L-TMDs）的光生載流子動(dòng)力學(xué)的同步觀測(cè)和操控，即時(shí)空操控了二維單層半導(dǎo)體的熒光暗態(tài)，如圖8所示。

圖8 借助FRAP顯微鏡時(shí)空操控二維單層半導(dǎo)體的熒光暗態(tài)的示意圖

二維過(guò)渡金屬硫族化合物單層（1L-TMDs，如MX2, M=W, Mo,  X=S, Se），因其高的熒光量子產(chǎn)率、易通過(guò)光/電調(diào)控的載流子濃度、高激子結(jié)合能（幾十meV到數(shù)百meV）、顯著的激子–激子湮滅效應(yīng)（EEA）等特點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注。另一方面，3個(gè)原子層的厚度的1L-TMDs表面具有大量的表面缺陷（主要是硫族元素缺陷），對(duì)其發(fā)光性能影響顯著。為此，作者以1L-TMDs為模型半導(dǎo)體，使用商用奧林巴斯FRAP顯微鏡研究了其光生載流子間的相互作用（圖9A所示），意外發(fā)現(xiàn)1L-TMDs表現(xiàn)出類似生物膜系統(tǒng)的FRAP行為，如圖9B和C所示。眾所周知，生物膜系統(tǒng)中的FRAP現(xiàn)象是由于生物膜的流動(dòng)性（膜分子擴(kuò)散）決定的。研究發(fā)現(xiàn)，1L-WS₂熒光恢復(fù)過(guò)程中半峰寬（FWHM）逐漸減小，明顯不同于生物膜FRAP過(guò)程中的FWHM逐漸增大的過(guò)程（圖9D和E）。作者提出1L-WS₂的這一過(guò)程為光物理過(guò)程，即1L-TMDs的FRAP行為源于光生載流子之間以及載流子與缺陷之間的相互作用（而非表面原子的擴(kuò)散）。作者對(duì)光生載流子濃度進(jìn)行了計(jì)算（以一個(gè)光子產(chǎn)生一個(gè)載流子估計(jì)），探測(cè)激光和泵浦激光功率分別為5 kW cm-²和40.8 kW cm^-2時(shí)，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的載流子濃度分別為~4.88×108 cm^-2和~8.34×1012 cm^-2（相鄰激子之間的距離分別為~452.5 nm和~3.5 nm）。因此，光斑尺寸為~0.7 mm泵浦激光刺激，將會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的激子間相互作用（譬如EEA效應(yīng)），而探測(cè)激光不會(huì)顯著引起這一效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這一FRAP現(xiàn)象具有普遍性：1L-WSe₂也表現(xiàn)出該FRAP行為，但是熒光恢復(fù)動(dòng)力學(xué)較1L-WS₂更快。

圖9 1L-WS2具有類似于生物膜體系的FRAP行為。(A) FRAP顯微鏡示意圖。探測(cè)光和泵浦光（泵浦時(shí)間為3–30 ms）均為連續(xù)光源（CW），波長(zhǎng)分別為488 nm和405 nm，在樣品表面光斑大小分別為~100mm和~0.7mm，功率分別為5 kW cm^-2和40.8 kW cm^-2，成像速度29.4幀/秒，樣品置于溫濕度可控的腔室中。(B) 1L-WS₂具有FRAP行為。泵浦光刺激后1L-WS₂熒光圖像上呈現(xiàn)高斯分布的熒光暗區(qū)。(C))1L-WS₂的 FRAP過(guò)程呈現(xiàn)單指數(shù)熒光恢復(fù)的特征。(D, E) 1L-WS₂在熒光恢復(fù)過(guò)程中半峰寬（FWHM）逐漸減小
為了深入理解這一FRAP現(xiàn)象的本質(zhì)，作者原位測(cè)量了1L-WS₂在這一過(guò)程中的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)該過(guò)程中1L-WS₂結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變（譬如缺陷形成或者產(chǎn)生相變），排除了材料結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的FRAP行為。原位熒光光譜測(cè)試表明，泵浦激光刺激之后，出現(xiàn)了明顯的帶電激子（X-）發(fā)射峰（位于1.97 eV，中性激子X(jué)⁰位于2.02 eV），且熒光恢復(fù)過(guò)程中X-相對(duì)于X⁰的比例逐漸減�。▓D10A–C）。這一結(jié)果確認(rèn)了X-的形成是泵浦激光照射導(dǎo)致的，并在熒光恢復(fù)過(guò)程中逐步轉(zhuǎn)變?yōu)閄。由于X-的形成需要自由載流子，這暗示著高功率的泵浦激光照射導(dǎo)致了自由載流子的形成（即光摻雜效應(yīng)）。如何理解這一現(xiàn)象呢？在本工作中，泵浦激光照射產(chǎn)生的載流子濃度范圍為3.27×10¹¹–2.9×10¹³cm^-2，如此高的載流子濃度下，電子–空穴之間的庫(kù)侖相互作用被削弱，激子–激子碰撞的幾率大大增加，激子容易解離成自由載流子（俄歇電離）。熒光壽命測(cè)試進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，泵浦激光刺激后，熒光壽命從刺激前的~440 ps縮短到了~350 ps，隨后又逐漸恢復(fù)到~440 ps，與原位熒光光譜測(cè)量時(shí)X-的演化相一致。這些結(jié)果確證，1L-WS₂熒光暗態(tài)是帶電激子的俄歇非輻射過(guò)程導(dǎo)致的�；�于這些實(shí)驗(yàn)事實(shí)，作者提出了1L-WS₂的FRAP過(guò)程的光物理機(jī)制（圖10D）。

圖10  1L-WS₂的FRAP過(guò)程熒光暗態(tài)的本質(zhì)。(A)原位熒光光譜表征。(B) FRAP機(jī)理。泵浦光照射下，1L-WS₂瞬間注入大量載流子，電子–空穴之間庫(kù)侖相互作用被削弱，激子–激子碰撞幾率大大增加，引起激子解離，表面缺陷捕獲解離的空穴后，1L-WS₂呈現(xiàn)帶電態(tài)，帶電激子的俄歇非輻射過(guò)程導(dǎo)致了1L-WS₂的熒光暗態(tài)。隨著被捕獲空穴從缺陷處逐漸釋放，1L-WS₂恢復(fù)到電中性狀態(tài)，熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)到初始的亮態(tài)
相對(duì)于零維的量子點(diǎn)，2D 1L-TMDs大平面的特性為位置可控的操控載流子提供了方便。為此，作者選擇了尺寸為~10mm的1L-WS₂，交替改變泵浦光和探測(cè)光功率，探究其對(duì)FRAP動(dòng)力學(xué)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，固定探測(cè)激光的功率，隨著泵浦激光功率的增加（1.6–142.8 kW cm^-2），1L-WS₂熒光暗斑的FWHM逐漸增大（最大FWHM約為~4mm），F(xiàn)RAP過(guò)程的動(dòng)力學(xué)逐漸變慢（圖11A, B）。有趣的是，固定泵浦激光的功率，隨著探測(cè)激光功率的增加（0.17–166.7 W cm^-2），F(xiàn)RAP過(guò)程的動(dòng)力學(xué)逐漸加快，1L-WS₂熒光暗斑的FWHM逐漸減�。‵WHM = ~0.5–5 mm,圖11C, D），這說(shuō)明激發(fā)光能夠促進(jìn)被捕獲空穴從缺陷處釋放出來(lái)（即光致去摻雜）。需要指出的是，盡管光摻雜效應(yīng)在2D 1L-TMDs發(fā)光材料領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛報(bào)道，但這一光致去摻雜效應(yīng)尚未見諸報(bào)道。這意味著，盡管大量存在的硫族元素缺陷在工作狀態(tài)下可能捕獲光生載流子降低2D 1L-TMDs發(fā)光效率，光照也能夠?qū)⑦@些被捕獲的載流子釋放出來(lái)，確保2D 1L-TMDs處于電荷平衡態(tài)。這一發(fā)現(xiàn)或許能夠解釋2D 1L-TMDs熒光閃爍不顯著的現(xiàn)象（在W cm^-2這個(gè)激發(fā)條件下）。

展望

FRAP顯微鏡自上個(gè)世紀(jì)70年代被發(fā)展出來(lái)，目前主要被生物學(xué)家用作研究生物體系中生物分子的擴(kuò)散和遷移，它在揭示生物分子功能和研究分子互作方面發(fā)揮了重要作用。然而，除了一些類生物膜分子的擴(kuò)散研究，F(xiàn)RAP顯微鏡尚未被廣大化學(xué)工作者所熟知和采用。
總體而言，生物體系中的FRAP實(shí)驗(yàn)聚焦在觀察生物分子的遷移。本文所列舉的幾個(gè)用FRAP顯微鏡研究光化學(xué)和光物理的例子表明，F(xiàn)RAP過(guò)程在化學(xué)領(lǐng)域也廣泛存在。與生物體系中的FRAP所不同的是，這些化學(xué)領(lǐng)域的FRAP過(guò)程與分子的擴(kuò)散往往沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)，而是與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，即分子層次可逆的化學(xué)反應(yīng)或者電子位態(tài)的可逆改變。總結(jié)起來(lái)，化學(xué)領(lǐng)域的FRAP過(guò)程，大致有以下幾個(gè)特點(diǎn)：
1）時(shí)間維度的FRAP過(guò)程，往往是局部區(qū)域可逆的物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變所致�；瘜W(xué)領(lǐng)域的FRAP過(guò)程可呈現(xiàn)毫秒到小時(shí)的時(shí)間跨度。
2）與生物體系中因物種擴(kuò)散而產(chǎn)生的FRAP現(xiàn)象相比，化學(xué)FRAP過(guò)程往往表現(xiàn)出FWHM逐漸減小的特點(diǎn)，這一現(xiàn)象很可能與刺激激光束的光強(qiáng)呈高斯分布有關(guān)。
3）除了刺激光強(qiáng)度影響FRAP動(dòng)力學(xué)，探測(cè)光也會(huì)顯著影響FRAP動(dòng)力學(xué)，根據(jù)化學(xué)體系的不同，可以呈現(xiàn)抑制恢復(fù)或者促進(jìn)恢復(fù)的效果。
4）化學(xué)領(lǐng)域所觀測(cè)到的FRAP現(xiàn)象，須結(jié)合多種原位結(jié)構(gòu)表征手段探究變化本質(zhì)，不能簡(jiǎn)單歸因于原子、分子或者電子擴(kuò)散，更不能生搬硬套生物膜FRAP的數(shù)學(xué)模型。

總之，化學(xué)乃變化之學(xué)。這些FRAP案例，生動(dòng)的展示了FRAP在操控化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和物質(zhì)狀態(tài)上的重要價(jià)值。筆者堅(jiān)信，未來(lái)將會(huì)涌現(xiàn)更多有趣的例子，充分發(fā)揮 FRAP這一研究工具在化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的價(jià)值。

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