韓國浦項科技大學(xué)Sungjune Jung教授團(tuán)隊使用MicroFab的按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II制備了三維（3D）肺泡屏障模型，以評估塵埃顆粒對細(xì)胞毒性、肺泡屏障結(jié)構(gòu)和肺泡屏障表面活性物質(zhì)分泌的生理影響，研究塵埃顆粒如何導(dǎo)致呼吸道疾病。全噴墨打印的肺泡屏障模型能夠高精度地模擬身體中的生理現(xiàn)象，可以用作毒理學(xué)的臨床前模型，并有助于將新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為有效的治療策略。

介紹

空氣中的微小塵埃顆粒通過呼吸道進(jìn)入我們的身體，并導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病。因此，分析塵埃顆粒對呼吸系統(tǒng)的影響一直受到人們的極大研究興趣。目前對于塵埃顆粒進(jìn)攻人體肺泡過程的研究類似于2D模型，并且在體內(nèi)發(fā)生的一些現(xiàn)象是經(jīng)過模擬推演的，無法準(zhǔn)確表達(dá)其過程。Sungjune Jung教授團(tuán)隊利用噴墨打印技術(shù)，通過在多孔基板上以高分辨率精確定位打印細(xì)胞，實現(xiàn)了對人體三層肺泡屏障模型的復(fù)現(xiàn)，從而在體外研究人類肺泡屏障中的塵埃顆粒毒理學(xué)。
 

▲ 圖1 研究過程示意圖。a)采用噴墨生物打印技術(shù)依次堆疊而成的肺泡屏障結(jié)構(gòu)；b)肺泡屏障構(gòu)建體的培養(yǎng)與成熟；c)塵埃顆粒毒理學(xué)研究。

肺泡屏障結(jié)構(gòu)是通過使用MicroFab按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II逐層打印四種不同的細(xì)胞類型來制造的，如圖1所示。將NCI‐H1703, NCI‐H441, MRC5, HULEC‐5a四種細(xì)胞溶液，經(jīng)過MicroFab噴墨打印系統(tǒng)精準(zhǔn)量化打印，打印的模型具有三層結(jié)構(gòu)，厚度約為10μm。通過疊層打印的方式（如圖1a），實現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞-基層細(xì)胞-上皮細(xì)胞的三層3D結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過7天的培育（如圖1b），完全復(fù)刻人體內(nèi)肺泡器官的組織結(jié)構(gòu)，并使用全噴墨打印的肺泡屏障結(jié)構(gòu)評估了大氣塵埃顆粒的危害。
 

▲ 圖2 塵埃濃度和暴露時間對肺泡屏障結(jié)構(gòu)的活力和性能的影響。

分析用不同濃度的塵埃（0-300μg/cm²）處理不同暴露時間（1-7天）的肺泡屏障結(jié)構(gòu)。為了驗證塵埃顆粒對組織增殖和代謝活性的有害影響，在每個時間點進(jìn)行了CCK-8測定，如圖2a，如圖2b測量TEER，以確定暴露于塵埃后的組織屏障的完整性。圖2c根據(jù)FITC-葡聚糖通過組織屏障的量來測定屏障通透性。100和300μg/cm²組暴露于顆粒物5天，導(dǎo)致屏障電阻顯著降低，對4 kDa FITC‐葡聚糖的滲透性顯著增加。
 

▲ 圖3 塵埃暴露后肺泡屏障結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞調(diào)亡。

為了觀察塵埃處理的肺泡屏障結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞凋亡，進(jìn)行了TUNEL測定，如圖3所示。TUNEL染色結(jié)果顯示，由于塵埃顆粒的濃度和時間依賴效應(yīng)，隨著塵埃暴露時間的增加，暴露于濃度為100μg/cm²或更高的塵埃會三層結(jié)構(gòu)坍塌，導(dǎo)致更多的細(xì)胞凋亡。

▲ 圖4 塵埃暴露7天后，肺泡屏障結(jié)構(gòu)的功能表征。

暴露于塵埃后7天，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，以證明三層組織屏障中基底膜的結(jié)構(gòu)組成，如圖4所示。圖4a研究了層粘連蛋白在基底膜中的分布，圖4b對IV型膠原進(jìn)行了免疫染色，圖4c研究了上皮中ATII細(xì)胞的表面活性劑分泌功能。

▲ 圖5 肺泡屏障構(gòu)建中mRNA的表達(dá)。

為了研究塵埃顆粒的影響，進(jìn)行了定量PCR（qPCR）來確定與細(xì)胞外基質(zhì)降解和肺功能障礙相關(guān)的mRNA表達(dá)水平。利用涉及促炎細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）（圖5a、圖5b）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP‐1和MMP‐9）（圖5c、圖5d）、整合素亞基（ITGA1和ITGB1）（圖5e、圖5f）和肺表面活性物質(zhì)蛋白（SP‐A和SP‐B）（圖5g、圖5h）的特異性標(biāo)記物，通過qPCR檢測相對mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，組織暴露于300μg/cm²的塵埃顆粒7天后，促炎細(xì)胞因子和MMPs的mRNA水平顯著升高。研究表明，塵埃顆粒有助于導(dǎo)致ECM周轉(zhuǎn)和結(jié)構(gòu)變化的酶的高表達(dá)水平，相反，整合素和表面活性劑蛋白的mRNA表達(dá)水平隨著塵埃濃度和暴露時間的增加而降低。因此，塵埃顆粒會抑制肺泡組織中呼吸表面活性劑的分泌，并有可能導(dǎo)致表面活性劑相關(guān)的生理功能障礙。

結(jié)論
全噴墨打印的肺泡屏障結(jié)構(gòu)的研究為吸入塵埃顆粒的有害影響提供了三個主要的新見解。暴露于高濃度塵埃顆粒的肺泡組織中的現(xiàn)象包括：1.促炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加；2.組織結(jié)構(gòu)的破壞和紊亂；3.與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因的上調(diào)或下調(diào)。全噴墨打印的肺泡屏障模型非常接近人體肺泡組織的形態(tài)、功能和微環(huán)境特征，意味著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可以使用全噴墨打印的方式來模仿制造人體器官可以用作毒理學(xué)的臨床前模型，并有助于將新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為有效的治療策略。

參考文獻(xiàn)：
[1] Kang, D., Lee, H., & Jung, S. (2022). Use of a 3D inkjet‐printed model to access dust particle toxicology in the human alveolar barrier. Biotechnology and Bioengineering, 119, 3668–3677.