2023年4月7日，浙江大學(xué)逯慧杰老師課題組應(yīng)用長光辰英核心產(chǎn)品——P300共聚焦拉曼光譜儀和S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)在《ACS ES&T Water》期刊上發(fā)表了題為“Phosphorus Removal and Storage Polymer Synthesis by Tetrasphaera-Related Bacteria with Different Carbon Sources”的論文。本研究整合了共聚焦拉曼光譜和熒光原位雜交技術(shù)來理解Tetrasphaera-PAO的代謝差異。


在廢水的處理中，生物除磷比化學(xué)除磷更具成本效益和可持續(xù)性。聚磷菌(PAO)在富碳厭氧(FEAST)條件下使用聚磷酸鹽(Poly-P)作為能源，將碳源轉(zhuǎn)化為生物大分子，如聚羥基烷酸酯(PHA)。在隨后的缺碳好氧(饑荒)條件下，磷酸鹽以多聚形式積累。有機(jī)碳源是影響磷釋放和吸收活性的關(guān)鍵因素。

Tetrasphaera能夠利用葡萄糖和氨基酸作為碳源。這些化合物提供了吸收磷所需的90%的能量，乙酸鹽、葡萄糖和甘油是強(qiáng)化廢水反硝化的常用碳源，并對其除磷動力學(xué)和化學(xué)計量進(jìn)行了比較。利用上述碳源，還沒有揭示Tetrasphaera-PAO的碳磷代謝特性。這項研究的總體目標(biāo)是揭示與Tetrasphaera相關(guān)的PAO的代謝多樣性以及不同碳源對其C和P代謝的調(diào)節(jié)。

具體目標(biāo)是：
(1)確定在復(fù)合有機(jī)物(酪蛋白氫裂解物)補(bǔ)給的除磷生物反應(yīng)器中Tetrasphaera-PAO的系統(tǒng)發(fā)育和代謝潛力；(2)揭示不同碳源(即乙酸鹽、葡萄糖和甘油)的Tetrasphaera-PAO的C和P代謝特征；以及(3)建立不同碳源下Tetrasphaera-PAO的代謝和能量模型。利用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)結(jié)合和拉曼光譜對Tetrasphaera-PAO中的多聚P、糖原和PHA等細(xì)胞內(nèi)儲存化合物進(jìn)行了原位定量。預(yù)期結(jié)果將為深入了解Tetrasphaera-PAO的碳來源依賴的代謝及其對全球廢水除磷的貢獻(xiàn)提供洞察。
 
在本研究中，我們確定了一個新的分支，Tetrasphaera為主要的聚磷菌在實驗室規(guī)模的除磷反應(yīng)器中富集。Tetrasphaera-PAOs在乙酸鹽下的釋磷和吸磷效率均高于甘油和葡萄糖。甘油和葡萄糖發(fā)酵提供的能量分別是多聚磷水解法的4倍和1.7倍，兩者之間的權(quán)衡導(dǎo)致磷的釋放較差。拉曼熒光原位雜交結(jié)果表明，聚羥基烷酸酯(PHA)是由乙酸酯合成的。另一方面，糖原是甘油和葡萄糖形成的關(guān)鍵儲能化合物。乙酸乙酯的好氧磷吸收效率分別是甘油和葡萄糖的4.4倍和1.8倍，這是因為PHA的水解提供了額外的能量。Tetrasphaera-PAO的代謝多樣性和發(fā)酵能力支持它們在EBPR中的流行，并強(qiáng)調(diào)了它們與群落中其他種群潛在的代謝相互作用。這項工作加深了我們對Tetrasphaera-PAO遺傳和代謝差異的理解，為在不同的碳源條件下優(yōu)化廢水除磷提供了有用的信息。
由圖2的研究結(jié)果，可以看出PAO包括C. accumulibacter(從4.97%到168天的0)和Microlunatus phosphovorus(168天<0.2%)，被Tetrasphaera-PAOs 擊敗并在實驗操作中被淘汰(圖2和圖3)。這可能是因為這些種群更喜歡使用小分子有機(jī)物，如乙酸鹽。Candidatus competibacter，典型的GAOs，從0.03%增加到1.71%，可以與Tetrasphaera-PAO競爭氨基酸。



圖2. (A)SBR群落中PAO和GAO種群的動態(tài)。數(shù)字和氣泡大小代表基于元基因組學(xué)的相對豐度(%)。(B)第168天SBR污泥的FISH圖像。Tetrasphaera-PAO以紅色顯示，Eubacteria以綠色顯示
  上述圖4結(jié)果表明分支1−3編碼兩條乙酰輔酶A合成途徑，分別涉及ACs和Ack-PTA，而分支4缺少ackA，因此可能僅使用ACs途徑(比Ack-Pta途徑消耗更多的ATP)。大多數(shù)Tetrasphaera-PAO(6/9 MAGs)缺乏甘油運(yùn)輸復(fù)合蛋白，導(dǎo)致甘油吸收的效率較低。在葡萄糖利用方面，分支1−3可以從葡萄糖合成糖原或通過糖酵解(通過傳統(tǒng)的Embden−Meyerhof−Parna，或emp途徑)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸酯，其中所有相關(guān)基因都是完整的。分支4 包含完整的糖原合成途徑，但缺少編碼6-磷酸果糖激酶的pfk1，從而催化EMP途徑中從6-磷酸果糖到1,6二磷酸果糖的速率限制步驟。另一種選擇是，分支4可能使用Entner−Doudoroff途徑進(jìn)行糖酵解，該途徑比EMP途徑更短，但產(chǎn)生的ATP更少。
 
Tetrasphaera PAO的胞內(nèi)多聚P、PHA和糖原作為P和C的儲存化合物因使用的碳源而不同(圖5)。在厭氧−好氧轉(zhuǎn)化過程中，乙酸鹽的釋放和吸收是最有效的，導(dǎo)致胞內(nèi)多聚磷的含量發(fā)生了劇烈的變化(相差2.75倍)。葡萄糖和甘油、PolyP變異相似(分別相差1.75倍和1.45倍)。另一方面，厭氧PHA只對乙酸酯有積累，而對葡萄糖和甘油沒有。然后在好氧階段消耗一小部分PHA(從7.39×10−13降至6.92×10−13 g C/cell)。甘油和葡萄糖的糖原積累和降解規(guī)律相似。然而，當(dāng)加入乙酸鹽時，糖原在厭氧階段迅速消耗能量，在好氧階段持續(xù)減少。值得注意的是，拉曼FISH能夠原位量化目標(biāo)細(xì)胞中的聚合物含量，而不是群落其他成員。此技術(shù)的準(zhǔn)確性可以通過細(xì)胞分選和單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)行驗證。上述結(jié)果證實了分支4 Tetrasphaera-PAOs具有從乙酸鹽合成PHA的潛力，不同于以前的研究表明大多數(shù)Tetrasphaera不能合成PHA。
 
為了進(jìn)一步驗證所構(gòu)建的 Tetrasphaera-PAO吸收不同碳源的代謝模型(圖4)，用Tetrasphaera-PAO的特異引物通過RT-qPCR定量測定了參與合成和儲存化合物水解的關(guān)鍵基因的表達(dá)水平(圖6)。這一結(jié)果與觀察到的三種碳源的糖原積累、多聚磷水解和積累模式是一致的。甘油和葡萄糖在厭氧期的GALU(編碼糖原合成酶)的變化比乙酸乙酯高5−7倍。在Tetrasphaera-PAO中，確實有甘油和葡萄糖被轉(zhuǎn)化為糖原作為儲能化合物。此外，ppk2(聚P水解酶)對乙酸酯的上調(diào)作用最強(qiáng)，對甘油的上調(diào)作用最低。ppk(多聚磷合成)在乙酸鹽的上調(diào)作用最強(qiáng)，在葡萄糖的作用下最低。
 
在本研究中，在實驗室規(guī)模的除磷反應(yīng)器中，一株新的與Tetrasphaera相關(guān)的發(fā)酵細(xì)菌被鑒定為主要的聚磷菌。它們在利用碳源方面具有代謝的多功能性，包括但不限于乙酸酯、甘油和葡萄糖，而只有乙酸酯能有效地去除磷，并形成PHA作為儲存聚合物。當(dāng)使用甘油和葡萄糖時，磷的吸收最小，這兩種有機(jī)物被轉(zhuǎn)化為糖原。甘油和葡萄糖發(fā)酵比多聚磷發(fā)酵提供更多的能量，但同時可能阻礙磷的釋放。在廢水EBPR中，發(fā)酵對Tetrasphaera聚磷菌的存活甚至優(yōu)勢起著關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了我們目前對關(guān)鍵但研究較少的PAO組的的理解，將有助于更好地解釋它們在廢水除磷以及在全球磷生物化學(xué)循環(huán)中的作用。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acsestwater.3c00046

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