前言

 

2021年03月，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高教授課題組在Journal of Pharmaceutical Analysis發(fā)表的題為 “Corydalis Rhizoma as a model for herb-derived trace metabolites exploration: A cross-mapping strategy involving multiple doses and samples”（IF：14.026）的研究成果。研究以延胡索為模型，采用：分析高劑量草藥提取物的代謝物，表征同一生物樣品中臨床劑量草藥提取物的代謝物；基于不同生物樣品中代謝物具有不同離子豐度的事實，應(yīng)用不同生物樣品的交叉圖譜來鑒定微量代謝物兩種方法。與不使用該策略相比，多檢出44種臨床劑量的草藥提取物代謝物。這項研究提高了目前草藥衍生代謝物表征方法的深度、廣度和準確性。

 

 

基本信息

 

延胡索作為草藥衍生微量代謝產(chǎn)物探索的模型：一種涉及多劑量和樣本的交叉映射策略

研究對象：延胡索

發(fā)表期刊：Journal of Pharmaceutical Analysis

影響因子：14.026

發(fā)表時間：2021年03月

合作單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院、華西醫(yī)院消化內(nèi)科

運用生物技術(shù)：UPLC-Q-TOF/MS液質(zhì)聯(lián)用

 

研究背景

 

體內(nèi)吸收的藥物成分及相關(guān)代謝物是疾病治療的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，解讀中草藥中多種成分的代謝物對揭示藥效學(xué)成分具有重要意義。但中草藥的化學(xué)成分多為低含量的次生代謝物，其體內(nèi)代謝物含量接近微量，難以實現(xiàn)全面的檢測和鑒定。延胡索（罌粟科）（中國延胡索）的干根莖，具有促進血液循環(huán)、促氣、止痛等作用。對延胡索生物堿的綜合代謝譜的研究較少，加上分析方法的固有局限，代謝物尚未完全發(fā)現(xiàn)，延胡索的藥效學(xué)成分也尚不清楚。目前迫切需要一種有效的代謝物檢測和鑒定方法。

 

研究思路

 

圖1.  延胡索生物堿代謝物鑒定所提出的分析策略匯總圖

 

研究方法

 

1.實驗材料：

植物：延胡索；化學(xué)試劑：LC/MS級的水，甲酸、乙腈、甲醇；原阿片堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、棕櫚堿標準品。動物：雄性SD大鼠（200±10）。

 

2. 樣本數(shù)量及分組：

2.1大鼠分組：38只大鼠分三組，糞便和尿組（12）、血漿組（¼12）和膽汁組（14）。糞便組和尿液組大鼠分為6組，分別口服4個參考標準品（2.00 mL，20mg/kg）、臨床劑量（0.56 mL）和大劑量（1.20 mL），分別采集12只大鼠給藥前后24 h的糞便和尿樣。血漿組：分組給藥方式同上，收集13個時間點血漿樣本。膽汁組：分組及給藥同，另多有2只大鼠為空白對照。10%水合氯醛麻醉進行膽管插管，收集膽汁0-12h和12-24h樣本。存于-80℃。

 

2.2延胡索樣品準備：研磨成粉過40目篩，將約20 g粉末在200 mL蒸餾水中浸泡1h，煎煮2次，每次30 min。合并提取液，最終溶解成40mL，相當于0.5g中藥（藥典中延胡索的臨床口服劑量為3-10g/人，因此，延胡索的臨床劑量為1.4 g/kg，即0.28g/大鼠（0.56 mL）。大劑量為3 g/kg，即0.6g/大鼠（1.2 mL)。

 

2.3血液、尿液和膽汁樣本的制備：樣品解凍后，各時間點混合200 uL血漿。將適量的混合樣品（血漿100 uL，尿液1 mL，膽汁150 uL）與三倍量的甲醇混合。渦旋30s后在4℃，12000rpm離心10min去除蛋白。上清液氮氣干燥，70%甲醇復(fù)溶并離心15min，取上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

 

2.4糞便樣品制備：200 mg糞便在4 mL甲醇中渦旋30 s，放置1h。然后在4℃，12000rpm離心15 min，上清液用氮氣干燥。甲醇復(fù)溶，離心15 min。上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

 

3. 采用的技術(shù)：Waters UPLC Class液相系統(tǒng)聯(lián)用Waters SYNAPT G2-SI MS質(zhì)譜系統(tǒng)。采用MassLynx V4.1軟件控制儀器并采集數(shù)據(jù)，UNIFI軟件進行數(shù)據(jù)處理。其實驗流程設(shè)計見圖1。

 

研究結(jié)果

 

1.母體化合物的碎裂模式

母體藥物和相關(guān)代謝物通常具有相同的骨架，其碎裂模式相似。為了更好地利用LC-MS技術(shù)對代謝物進行分析，有必要充分了解母體化合物的碎裂方式。延胡索生物堿主要分為四氫小檗堿、原小檗堿、原阿片堿和阿樸啡四種類型。

圖S1. 四氫小檗堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑    

圖S2. 延胡索乙素的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

 

如圖S1和S2示，四氫小檗堿和延胡索乙素均有飽和C環(huán)，易發(fā)生RDA裂解，原阿片堿結(jié)構(gòu)與四氫小檗堿相似，也易發(fā)生RDA裂解（圖S3）。RDA裂解后通過進一步脫水形成最豐富的片段離子。而棕櫚堿C環(huán)不飽和，極難形成RDA裂解（圖S4）。酰胺基中存在弱鍵，因此阿樸啡型生物堿很容易失去（CH3）2NH或CH3NH2取代基，產(chǎn)生最豐富的[M-45.0578]⁺或[M-31.0344]⁺片段作為特征離子（圖S5）。

圖S3. 原阿片堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

圖S4. 棕櫚堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

 

圖S5. 海罌粟堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

 

2.代表性化合物的代謝研究

選擇四氫小檗堿、延胡索乙素、原阿片堿和棕櫚堿并根據(jù)文獻總結(jié)的母體代謝途徑鑒定這些成分的代謝途徑（圖2）。四種具有代表性化合物的所有代謝物均列于表S1-S4（補充材料）。基于MS信息和標準品中總結(jié)的代謝途徑，提出了MCFs來表征延胡索提取物的代謝產(chǎn)物（表1）。

圖2. (A)四氫小檗堿、(B)延胡索乙素、(C)原阿片堿和(D)棕櫚堿的代謝途徑

 

表1. 延胡索衍生代謝物的代謝特征片段（MCFs）

 

3.建立化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選表

值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)延胡索生物堿的骨架在代謝過程中沒有變化。因此，根據(jù)替代品的類型和數(shù)量以及體內(nèi)代謝途徑總結(jié)了化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選表（表2-4），為結(jié)構(gòu)鑒定提供參考。

表4. 原小檗堿化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選表（篇幅原因，此處只放表4，表2-3模式同此表）

紅色數(shù)字表示與延胡索代謝產(chǎn)物匹配的準分子離子

 

4.延胡索衍生化合物的綜合鑒定

4.1初篩中檢測到的代謝物的鑒定：以臨床劑量延胡索提取物血漿樣品中的代謝產(chǎn)物MN-100為例說明了鑒定過程（圖3）。在正離子模式下，準分子離子為m/z504.1881[M+H]⁺，化學(xué)式為C25H29NO10。碎片離子m/z328.1548[M+H]⁺是葡萄糖醛酸化的代謝物，并在表2中檢索到分子離子及7種對應(yīng)的代謝物結(jié)構(gòu)。表明MN-100與四氫小檗堿具有相同的骨架，在C2-C3位置有兩個羥基取代，在C13位置有一個甲基取代，在C9-C10位置有一個葡萄糖醛酸和一個甲氧基。MN-100的質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)圖如圖4所示。

圖3. 臨床延胡索提取液給藥血漿樣品的色譜圖。(A)m/z 504.1881的提取物離子色譜圖，(B)血漿樣品的總離子色譜圖

表2. 四氫小檗堿化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選表

 

圖4. MN-100的質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)

 

4.2以高劑量延胡索提取物的代謝物為偽標準來鑒別臨床劑量的方法：圖5A中的代謝物MN-106由于豐度低、峰形差，在初篩中未檢測到。然而，在相同的保留時間，高劑量血漿樣品中的代謝產(chǎn)物MH-119被鑒定為甲基化和葡萄糖醛酸化的延胡索乙素。臨床劑量和高劑量提取物的血漿樣本中m/z 518.2028的EICs如圖5A所示。在MS/MS譜（圖5B）中，臨床劑量提取物樣品中的碎片離子響應(yīng)值較低，幾乎淹沒在基線中，但具有與高劑量樣品中相同的碎片模式，說明臨床劑量提取物樣品中也存在MH-119。

圖5. 在臨床劑量和高劑量提取物的血漿樣品中，m/z 518.2028的提取物離子色譜(A)和MS/MS光譜(B)

 

4.3通過對不同生物樣本的交叉定位，鑒定不同樣品中的微量代謝物:同一生物樣品在不同劑量下獲得的代謝物幾乎完全一致，因此該方法有助于對同一樣品中的代謝物的鑒定。通過保留時間和m/z值，將一個樣品中豐度較強的代謝物相應(yīng)地映射到其他三個樣品中，從而可以識別出不同樣品中的微量代謝物。以臨床劑量延胡索血漿樣本中的代謝物MN-28和MN-29為例，說明該策略。如圖6A和B所示，在不同劑量的血漿樣品中，這兩個峰的MS響應(yīng)很弱。

圖6. m/z 342.1715的提取物離子色譜圖： (A)臨床劑量血漿樣本、(B)高劑量血漿樣本和(C)臨床劑量尿液樣本

 

從高劑量到臨床劑量的方法不能從血漿樣本中識別，在尿液樣本中檢測到6種準分子離子342.1715[M+H]⁺的代謝物。在尿樣的初篩結(jié)果中，保留時間分別為9.05 min和9.83 min的峰被鑒定為氫化四氫小檗堿。在m/z178.0859[M+H-C10H12O2]⁺處的片段離子反應(yīng)表明其結(jié)構(gòu)與四氫小檗堿相似，在表2中搜索了理論準分子離子m/z 342.1705，四氫小檗堿骨架的C-2、C-3、C-9和C-10處可能有3個甲氧基和1個羥基，表明氫化反應(yīng)發(fā)生在A環(huán)，其結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜如圖7示。如圖6A和B所示，從血漿樣品中提取m/z 342.1715的離子，與在尿液中相同的保留時間內(nèi)獲得四個具有相同m/z值的色譜峰（圖6C）。

圖7. MN-28和MN-29的質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)

 

4.4延胡索生物堿的結(jié)構(gòu)與代謝的關(guān)系：延胡索生物堿的結(jié)構(gòu)與代謝密切相關(guān)。去甲基化是最常見和頻率最高的代謝反應(yīng)。從圖8可以看出，棕櫚堿在甲氧基取代時最容易發(fā)生去甲基化，其次是延胡索乙素、四氫小檗堿和原阿片堿，甲基化反應(yīng)則相反。其余的羥基容易發(fā)生硫酸鹽化和葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化和硫酸化反應(yīng)只發(fā)生過一次，而不是同時發(fā)生。只有兩種代謝物被檢測到被硫酸化兩次。

圖8.四個參考標準中代謝物類型的相對百分比

 

含亞甲基二氧基的組分會失去一個CO分子，而不含取代基的組分不會發(fā)生裂解，如延胡索乙素和棕櫚堿的情況所示。原阿片堿類生物堿的五元含氧環(huán)和碳基易于氫化。前者變成一個甲氧基和一個羥基，后者變成一個羥基。羥基不穩(wěn)定，容易發(fā)生脫羥基化。二羥基化在其他結(jié)構(gòu)類型中沒有發(fā)生。原小檗堿型生物堿由于不飽和C環(huán)而沒有發(fā)生RDA裂解。因此，其結(jié)構(gòu)難以確定，在代謝過程中非常穩(wěn)定。棕櫚堿只發(fā)生去甲基化和羥基化反應(yīng)，代謝產(chǎn)物主要分布在糞便中，而不是分布在膽汁中，提示它可能是由腸道而不是肝臟代謝的。

 

中藥的體內(nèi)代謝過程非常復(fù)雜，代謝物的結(jié)構(gòu)多樣化，這使其作用機制難以解釋。因此，明確代謝物的結(jié)構(gòu)對于證明藥物的作用機制具有重要意義。比體外化學(xué)成分更豐富的結(jié)構(gòu)代謝產(chǎn)物類型，將有助于尋找延胡索的生物活性成分。

 

研究結(jié)論

 

 

1.研究采用不同樣品和劑量的交叉組合，從臨床標準和從高標準到臨床劑量的策略中檢測到127種代謝物。

2.將化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選表與特征片段離子相結(jié)合，闡明了代謝物的結(jié)構(gòu)。

3.繪制了四種具有代表性標準的大鼠更準確的代謝途徑，并證實了延胡夫生物堿的結(jié)構(gòu)與代謝之間的關(guān)系。

 

文章推薦

 

1.該策略在草藥衍生代謝產(chǎn)物研究中具有優(yōu)勢。解決了生物樣品基質(zhì)響應(yīng)高、代謝物濃度低、峰形不明顯、MS/MS信息缺失等問題。

2.本研究提出的策略將是發(fā)現(xiàn)藥效學(xué)物質(zhì)和代謝機制研究的有力工具。

 

參考文獻

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[2] S.T. Yu, H.X. Liu, K. Li, et al., Rapid characterization of the absorbed constituents in rat serum after oral administration and action mechanism of Naozhenning granule using LC-MS and network pharmacology, J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 166 (2019) 281e290.

[3] H.Y. Zhang, S.R. Duan, L. Wang, et al., Identifification of the absorbed components and their metabolites of Tianma-Gouteng granule in rat plasma and bile using ultra-high-performance liquid chromatography combined with quad rupole time-of-flflight mass spectrometry, Biomed. Chromatogr. 33 (2019), e4480.