導讀

 

慢性炎癥和T細胞失調(diào)在感染人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的個體中持續(xù)存在，即使在成功的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后也是如此。所涉及的機制尚未完全理解。在這里，我們使用Olink蛋白質(zhì)組學全面分析了慢性HIV-1感染個體中的異常炎癥相關(guān)蛋白（IRP），包括24個未接受治療個體、33個免疫應(yīng)答者和38個免疫無應(yīng)答者。使用流式細胞術(shù)評估T細胞功能障礙為T細胞耗竭、活化和分化。我們鑒定了一組IRP，包括CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10和IL18，它們與慢性HIV-1感染期間T細胞失調(diào)密切相關(guān)。有趣的是，聚類5中的IRP，包括ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7，與HIV-1能力大小呈負相關(guān)。我們還鑒定了CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5，這可能有助于區(qū)分免疫應(yīng)答者和免疫無應(yīng)答者�？傊�，不同的炎癥環(huán)境與T細胞的免疫恢復密切相關(guān)，我們的結(jié)果為慢性HIV-1感染期間的免疫失調(diào)提供了參考。

 

 

論文ID

 

原名：Distinct inflammation-related proteins associated with T cell immune recovery during chronic HIV-1 infection

譯名：慢性HIV-1感染期間與T細胞免疫恢復相關(guān)的炎癥相關(guān)蛋白

期刊：Emerging Microbes & Infections

IF：19.568

發(fā)表時間：2022.12

通訊作者：王福生、宋錦文

通訊作者單位：中國科學技術(shù)大學、國家感染性疾病臨床醫(yī)學研究中心

 

實驗設(shè)計

 

實驗結(jié)果

 

1. 研究參與者的特征

 

為了研究HIV-1感染者血漿IRP的特征和臨床意義，本研究包括四組：20個健康個體（HCs）、24個未經(jīng)過治療的HIV-1的個體（TNs）、33個免疫應(yīng)答者（IRs）和38個免疫反應(yīng)無應(yīng)答者（INR）（圖1）。表1總結(jié)了參與者的特點，INR組年齡大于IR組，此外，INR組的基線CD4 T細胞計數(shù)低于IR組。

圖1. 研究設(shè)計

 

外周血單核細胞（PBMC）和血漿采集自HCs、TNs、IRs和INRs。流式細胞術(shù)用于評估T細胞功能障礙，包括T細胞耗竭、活化和分化。使用O-link炎癥面板測量92種IRP，還獲得了參與者的臨床參數(shù)，以分析IRP與HIV-1臨床參數(shù)和T細胞失調(diào)之間的關(guān)系。

表1. 研究對象的臨床特征

 

連續(xù)變量表示為中位數(shù)，分類變量表示為病例數(shù)。HC：健康對照；TN：未經(jīng)過治療的HIV-1的個體；IR：免疫應(yīng)答者；INR：免疫無應(yīng)答者；BMI：體重指數(shù)；ART：抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法；NA：不可用；LDL：低于檢測下限；NRTI：核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；NNRTI：非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；PI：蛋白酶抑制劑。

 

2. HIV-1感染個體的T細胞分化

 

我們使用流式細胞儀分析評估了HIV-1感染個體的CD4和CD8 T細胞亞群組成�；�于CD45RA、CD27和CCR7的表達來鑒定T細胞亞群。使用統(tǒng)一方法可視化了四組PBMC中T細胞亞群的分布和CD8、CD45RA、CD27和CCR7的表達（圖2A）。在CD4 T細胞中，過渡記憶（T_TM）細胞的頻率降低，但與HCs相比，TNs中效應(yīng)記憶（T_EM）和末端分化（T_TD）細胞的頻率增加（圖2B）。在CD8 T細胞中，TN的中心記憶（T_CM）細胞的頻率降低，而TNs中T_TM和T_EM細胞的頻率比HCs中更多（圖2C）。雖然ART長期抑制HIV-1復制，但T細胞亞群的分布并未完全恢復。在INRs中，CD4⁺ T_EM的頻率、CD8⁺T_EM和CD4⁺T_TD細胞增加，CD4⁺T_N的頻率和CD8⁺T_N細胞與IRs和HCs相比有所下降（圖2B&C）。

圖2. HIV-1感染個體的T細胞亞群

 

使用流式細胞術(shù)測定外周血單個核細胞（PBMC）中CD45RA、CD27和CCR7的表達。T細胞亞群的定義如下：未經(jīng)處理的（T_N；CD45RA^-CD27⁺CR7⁺）、中心記憶（T_CM；CD45RA^-CD27⁺CCR7⁺）、過渡記憶（T_TM；CD45LA⁻CD27⁺CCR7^-）、效應(yīng)記憶（T_EM；CD45RA⁻CD27^-CR7^-）和末端分化/效應(yīng)器（T_TD/TE；CD45LA⁺CD27⁺CCR6^-）。（A） HCs、TNs、IRs和INRs中T細胞亞群的整合分析。高維映射上的每個點代表一個單獨的細胞，以不同的顏色顯示細胞亞群；（B-C）HCs中（B）CD4和（C）CD8 T細胞亞群的比例（n=20），TNs（n=23），IRs（n=33）和INRs（n=38)。數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，每個點代表一個參與者。使用非參數(shù)非配對Mann-Whitney U檢驗確定兩組之間的統(tǒng)計顯著性。

 

我們還評估了T細胞上活化和耗竭標記物的表達。我們發(fā)現(xiàn)，與HCs相比，TNs的T細胞活化和耗竭顯著增加，ART不能完全恢復正常功能，尤其是INRs。INR組中HLA-DR⁺、CD38⁺和HLA-DR⁺ CD38⁺CD4 T細胞的頻率高于IR組，而對于PD-1⁺CD4和PD-1⁺CD8的T細胞，INRs組高于IRs和HCs組。

 

3. 血漿中可溶性IRPs

 

我們使用Olink多重炎癥小組測量了92個IRP，以研究HIV-1感染個體血漿IRP的臨床意義�；�于IRP表達的t-SNE分析清楚地將HCs、TNs和HIV-1感染的ART患者分開（圖3A）。HIV-1感染個體（TNs、IRs和INR）和HCs之間有52個IRP顯著差異（圖3B）；TNs和HCs之間有41個IRP顯著差異，IRs和HCs之間有26個IRP顯著差異，INR和HCs間有34個IRP顯著差異。此外，27個IRP在IRs和TNs之間存在顯著差異，27個INR和TNs，9個IRs和INR。使用熱圖顯示這些IRP的差異表達（圖3C）。HIV-1感染的個體和HCs，特別是TNs之間的IRP譜顯著不同。

圖3. HIV-1感染個體血漿中炎癥相關(guān)蛋白的改變

 

（A）基于使用Olink平臺檢測到的血漿中IRP，對具有不同類別的個體進行分布式隨機相鄰嵌入可視化；（B）Venn圖顯示了不同組合中差異表達IRP的數(shù)量[TNs與HCs、IRs與HCs、INRs與HCs]；（C）差異表達IRP的熱圖。

 

4. IRPs與TNs中HIV-1疾病進展相關(guān)

 

我們評估了TNs和HCs中41個差異表達IRP之間的成對相關(guān)性。根據(jù)相關(guān)系數(shù)將IRP分為七個聚類（圖3A）。結(jié)合圖3C所示的結(jié)果，HIV-1感染導致聚類1、4和5中IRP水平降低，聚類6和7中IRP水平升高。

我們進一步評估了IRP與TNs臨床和免疫學變量之間的相關(guān)性；聚類7中的IRP與HIV-1疾病進展密切相關(guān)（圖4B）。在聚類7中的IRP中，CD4 T細胞計數(shù)與CSF1、CXCL11、CCL23、IL12B、CCL19和CXCL10的水平呈負相關(guān)。HIV-1病毒載量與CSF1、CXCL11、IL12B、CCL19、IL10和CXCL9水平呈正相關(guān)。CD4⁺T_N和CD8⁺T_N細胞的頻率與CSF1、CXCL11、CCL23、IL12B、CCL19、TNFRSF9、IL10、CXCL9、TNF、CXCL10和IL18的水平呈負相關(guān)。HLA-DR⁺CD38⁺CD4 T細胞的頻率與CXCL11、CXCL9、CXCL10和IL18R1的水平呈正相關(guān)。HLA-DR⁺CD38⁺CD8 T細胞的頻率與CXCL11、IL15RA、IL12B、CXCL9、TNF和CXCL10的水平呈正相關(guān)。PD-1⁺CD4 T細胞的頻率與CSF1、CXCL11、CCL23、IL15RA、IL12B、CCL19、TNFRSF9、IL10、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1、IL18R1和IL18的水平呈正相關(guān)。PD-1⁺CD8 T細胞的頻率與IFN-γ、IL15RA、TNFRSF9和IL18R1的水平呈正相關(guān)。

圖4. 未經(jīng)治療的HIV-1感染個體中炎癥相關(guān)蛋白與臨床和免疫學變量的相關(guān)性

 

確定了TNs和HCs之間IRP的差異表達，（A）炎癥相關(guān)蛋白（IRP）之間的相關(guān)性使用Spearman相關(guān)矩陣顯示�；�于IRP之間的相關(guān)性，這些蛋白質(zhì)被分成七個聚類，聚類在熱圖黑框中突出顯示；（B）熱圖顯示差異表達蛋白與臨床和免疫學變量之間的Spearman相關(guān)性，紅色和藍色分別表示正相關(guān)和負相關(guān)的關(guān)系。

 

我們還對聚類7中的17個IRP進行了GO分析，發(fā)現(xiàn)最具代表性的類別是炎癥反應(yīng)、NIK/NF-κB信號通路、趨化因子介導的信號通路、細胞對脂多糖的反應(yīng)和干擾素-γ相關(guān)通路，這表明這些生物過程是在HIV-1感染期間發(fā)生改變。

 

5. IRP與ART患者的免疫恢復相關(guān)

 

我們發(fā)現(xiàn)，ART后，聚類7中CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1、CST5、CDCP1和IL18的水平仍然異常。對ART患者的IRP與臨床和免疫學變量之間的相關(guān)性分析表明，聚類7中的IRP異常與臨床參數(shù)密切相關(guān)（圖5）。在ART患者中，CD4 T細胞計數(shù)和CD4/CD8比值與CXCL11水平呈負相關(guān)。CD4⁺T_N和CD8⁺T_N細胞的頻率與CXCL11和IL18的水平呈負相關(guān)，HLA-DR⁺CD38⁺CD8T細胞的頻率和CXCL9的水平呈正相關(guān)，PD-1⁺CD4T細胞的數(shù)量與SLAMF1和IL18水平呈正相關(guān)。此外，我們測量了ART患者的HIV-1 DNA和細胞相關(guān)的未剪接RNA。ART治療患者的HIV-1DNA水平與HIV-1RNA水平呈正相關(guān)。在聚類5中檢測到HIV-1 DNA與ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7水平之間存在顯著的負相關(guān)（圖5）。CDCP1水平與HIV-1 RNA水平呈正相關(guān)（圖5）。有趣的是，對IRs和INR中IRP與臨床和免疫學變量之間的相關(guān)性的評估表明，聚類5中的大多數(shù)IRP，包括CXCL5、ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP和IL7，與IRs中的HIV-1 DNA水平呈負相關(guān)，但與INR中的HIV-1DNA水平無關(guān)。

圖5. 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）治療的HIV-1感染者與HCs之間的炎癥相關(guān)蛋白（IRPs）差異表達

 

熱圖顯示了差異表達蛋白與臨床和免疫學變量之間的Spearman相關(guān)性，紅色和藍色分別表示正相關(guān)和負相關(guān)。

 

為了確定可區(qū)分INRs和IRs的IRP，使用多變量線性回歸檢查了IRs和INRs之間九種顯著差異表達的蛋白質(zhì)，包括CDCP1、OPG、CD5、uPA、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和Flt3L。六個IRP是具有統(tǒng)計學差別的，包括CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5。受試者操作特征曲線分析表明，這六種蛋白質(zhì)的評分值為95.06%（圖6A）。在六個IRP中，INR中CDCP1、CXCL11、CST5和SLAMF1的水平高于IR，而INR中TRANCE和CD5的水平低于IRs（圖6B）。我們還分析了這六種IRP在TNs中的表達，根據(jù)低和高CD4T細胞計數(shù)和病毒載量將其分為兩組。兩組之間的IRP沒有差異。

圖6. 炎癥相關(guān)蛋白用于區(qū)分血漿中的免疫應(yīng)答者和免疫無應(yīng)答者

 

（A）六種差異表達的炎癥相關(guān)蛋白（IRP），包括CDCP-1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5，用于區(qū)分INRs和IRs。（B）INRs和IRs中CDCP-1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5的表達水平。數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，兩組之間的統(tǒng)計顯著性通過非參數(shù)、非配對Mann-Whitney U檢驗確定，AUC表示曲線下面積。

 

此外，我們對IRs和HCs之間的26個差異表達IRP以及INR和HCs中的34個差異表達的IRP進行了GO分析。在前10個生物過程中，細胞對LPS的反應(yīng)是INRs所明顯富集的。一致地，先前的一項研究表明，INRs中的脂多糖（LPS）血漿水平高于IRs。LPS是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，具有高度抗原性。LPS在HIV-1感染期間負責慢性免疫激活和炎癥。

 

討論

 

雖然使用ART成功控制了HIV-1病毒血癥，但HIV-1感染者，尤其是INRs人群，仍經(jīng)歷了較高的非艾滋病相關(guān)事件發(fā)生率，這部分歸因于殘留的慢性炎癥和免疫激活。在這項研究中，我們系統(tǒng)地分析了具有不同疾病狀態(tài)的HIV-1感染個體的IRP，并分析了這些IRP與T細胞功能障礙和HIV-1疾病進展的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)HIV-1感染改變了T細胞分化、活化和耗竭。IRPs的異常表達與HIV-1疾病進展和T細胞功能障礙密切相關(guān)（圖7）。

圖7. 顯著改變HIV-1感染個體的炎癥相關(guān)蛋白及其與免疫恢復的關(guān)系

 

HIV-1感染導致炎癥相關(guān)蛋白（IRPs）的上調(diào)，包括CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、IL18、CDCP1和SLAMF1。雖然進行了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（ART），這些IRP仍然異常，特別是在INRs中。重要的是，聚類7中的這些IRP與T細胞分化、活化和耗竭密切相關(guān)。

 

在我們的研究中，與IRs相比，INRs年齡更大，基線CD4 T細胞計數(shù)更低，這與之前的研究一致，研究表明，年齡更大和基線CD4T細胞計數(shù)低與HIV-1感染個體的免疫恢復不良相關(guān)。先前的研究表明，T_N細胞隨著年齡的增長而減少，并表現(xiàn)出增殖和效應(yīng)器分化缺陷，進一步導致老年患者的T細胞功能障礙和活化。

 

HIV-1感染誘導的T細胞功能障礙不能通過ART治療完全恢復，尤其是INRs。與先前研究的結(jié)果一致，與IR和HC相比，我們觀察到INR中CD4⁺T_N和CD8⁺T_N細胞的頻率降低，以及CD4⁺T_EM和CD8⁺T_EM細胞的頻率增加。T_N細胞頻率降低可能與胸腺輸出減少以及T細胞分化為記憶和效應(yīng)T細胞有關(guān)。T_EM細胞可以遷移到發(fā)炎的外周組織并發(fā)揮效應(yīng)器功能；然而，T_EM細胞頻率的增加可能與INR的過度激活和加速耗竭有關(guān)。此外，與HCs和IRs相比，INRs的T細胞活化和耗竭更高。免疫激活的機制是復雜的。腸道微生物轉(zhuǎn)移到血液中是HIV-1感染期間全身免疫激活的一個原因。LPS是一種微生物易位的指標，在HIV-1感染期間顯著增加，INRs中的LPS高于IRs。此外，調(diào)節(jié)性T細胞在抑制T細胞活化和增殖方面發(fā)揮著重要作用。然而，HIV-1感染個體的調(diào)節(jié)性T細胞減少，可能導致異常免疫激活。

 

炎癥是HIV-1感染的標志，但IRP與T細胞失調(diào)之間的聯(lián)系尚未完全了解。因此，我們評估了92個IRP的水平，發(fā)現(xiàn)聚類7中的CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1和IL18與T細胞分化、T細胞活化和耗竭以及TNs的疾病進展密切相關(guān)。ART后，HCs和TNs之間一些差異表達的IRP仍然異常，特別是聚類7中的蛋白質(zhì)。特別是，聚類7中的CXCL9、CXCL10和CXCL11與疾病進展和免疫紊亂密切相關(guān)。CXCL9，CXCL10，CXCL11是IFN-γ誘導的趨化因子，由單核細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞分泌，并與細胞表面CXCR3相互作用。這些配體與CXCR3的相互作用影響T細胞向炎癥區(qū)域的遷移及其向效應(yīng)T細胞的極化。此外，CXCL9、CXCL10和CXCL11在調(diào)節(jié)T_N細胞向Th1細胞的分化和免疫激活中發(fā)揮重要作用。

 

Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF和IL2，并通過刺激細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞來促進免疫反應(yīng)。IL18主要由樹突狀細胞和巨噬細胞分泌，可能通過驅(qū)動IFN-γ分泌影響CXCL9、CXCL10和CXCL11的產(chǎn)生。先前的一項研究表明，CXCL9、CXCL10和CXCL11水平可以預測原發(fā)性HIV-1感染期間的HIV-1疾病進展。因此，阻斷CXCL9、CXCL10和CXCL11/CXCR3軸顯示出作為減少免疫激活和衰竭的途徑的潛力。多元回歸分析表明，CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5的組合可用于區(qū)分INRs和IRs。CDCP1是T細胞上表達的CD6的配體，在免疫突觸中充當共刺激受體，被認為是治療惡性腫瘤的分子靶點。如前所述，CXCL11與HIV-1疾病進展相關(guān)。

 

CST5編碼組織蛋白酶家族幾種半胱氨酸蛋白酶的抑制劑，是候選的腫瘤抑制基因。CST5和TRANCE可以抑制破骨細胞的活化和吸收，這可能與HIV-1相關(guān)的骨疾病有關(guān)。SLAMF1，也稱為CD150，在HIV-1感染的免疫抑制中發(fā)揮重要作用。急性HIV-1感染患者的T細胞CD150表達降低，這與Th1細胞介導的應(yīng)答受損相關(guān)。CD5被廣泛報道參與調(diào)節(jié)T細胞和B細胞中抗原受體的信號傳導。我們發(fā)現(xiàn)INRs的CD5水平低于IRs，這可能反映了免疫激活反應(yīng)能力低下。

我們發(fā)現(xiàn)聚類5中的ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7與HIV-1 DNA呈負相關(guān)。ST1A1是一種胞漿硫轉(zhuǎn)移酶，調(diào)節(jié)單核細胞衍生巨噬細胞中HIV-1逆轉(zhuǎn)錄。CASP8是一種半胱天冬酶蛋白，是參與激活級聯(lián)的上游蛋白酶，負責死亡受體誘導的細胞死亡。SIRT2是去乙酰化酶（sirtuin）家族的成員，由NAD⁺依賴性脫乙酰酶組成，參與多種細胞過程。SIRT2可以通過脫乙酰酶p65調(diào)節(jié)NF-κB信號傳導，這可能影響HIV-1潛伏期。AXIN1是WNT信號的調(diào)節(jié)器，在正常細胞培養(yǎng)條件下，通過WNT信號通路在HIV-1轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮負作用。STAMBP，也稱為AMSH，通過負調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體失穩(wěn)來抑制炎癥因子的釋放。先前的一項研究報告稱，STAMBP的結(jié)構(gòu)失穩(wěn)導致HIV-1出芽期間功能喪失。

 

CD40，也稱為TNFRSF5，與配體CD40L相互作用，通過誘導HIV抑制性趨化因子和支持抗HIV抗體和細胞毒性T細胞的產(chǎn)生，有助于HIV-1復制的免疫控制。IL7對于T細胞存活和外周T細胞的穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。IL7顯著增強HIV-1前病毒再激活。盡管在這些蛋白質(zhì)和HIV-1 DNA之間觀察到了負相關(guān)，但它們的因果關(guān)系需要進一步調(diào)查。此外，我們發(fā)現(xiàn)聚類5中的ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7與IRs中的HIV-1 DNA呈負相關(guān)，但與INRs中的HIV-1DNA無相關(guān)。HIV-1 DNA在具有最佳免疫狀態(tài)的IRs中相對穩(wěn)定。然而，INR易受機會性感染的影響。HIV-1在再激活時的免疫監(jiān)測減弱，再加上感染誘導的免疫激活，可能會影響INR中HIV-1的穩(wěn)定性。此外，與IRs相比，INRs具有更高水平的HIV-1 DNA和RNA。

 

這項研究有幾個局限性。首先，IRP影響T細胞免疫恢復的機制需要進一步分析，因為關(guān)聯(lián)不一定表明因果關(guān)系；第二，我們的研究中基于PCR的檢測高估了HIV-1的大小，因為它無法區(qū)分復制能力和有缺陷的前病毒基因組。最后，由于缺乏樣本，我們無法評估T細胞亞群的功能，包括細胞毒性和細胞因子分泌能力，未來的研究需要揭示異常IRP與T細胞功能的關(guān)系。

 

總之，在ART治療的HIV-1感染個體中，炎癥和T細胞失調(diào)持續(xù)存在。無論患者是否接受ART治療，聚類7中的一些IRP，如CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10和IL18，均與HIV-1疾病進展和免疫紊亂密切相關(guān)，這些結(jié)果可能有助于確定有效的免疫干預策略。

 

原文鏈接： 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2022.2150566