新鮮冷凍（FF）和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本均適用于多重免疫組化（mIHC/mIF）。開展多重免疫組化（mIHC/mIF）的樣品制備方法時(shí)，應(yīng)考慮保存組織結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件、抗原可及性和易于進(jìn)行組織成像。FFPE標(biāo)本處理法比大多數(shù)FF方法更好地保留了整體組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。實(shí)踐中，為方便室溫保存，大多數(shù)臨床組織以FFPE塊的形式保存，但FFPE法使許多目標(biāo)抗原無法充分暴露，常常需要抗原修復(fù)。此外，福爾馬林固定也增加自體熒光。特別要注意的是，與單一標(biāo)記物IF/IHC相比，適用于一個(gè)抗原修復(fù)的條件可能不適用另一個(gè)抗原修復(fù)，使得多重免疫組化（mIHC/mIF）的開發(fā)頗具挑戰(zhàn)性。相反，F(xiàn)F組織不需要抗原修復(fù)，但需要立即快速冷凍和超低溫儲(chǔ)存（<-80°C），以實(shí)現(xiàn)最佳組織保存。好消息是，使用1%多聚甲醛和去污劑法已被證明能夠很好地保存組織結(jié)構(gòu)，還能通過溶解紅細(xì)胞使組織熒光最小化，并且能夠在人類和小鼠組織中無需使用抗原修復(fù)，大多數(shù)抗體就可以直接進(jìn)行免疫染色。

成本

在規(guī)劃開展多重免疫組化（mIHC/mIF）業(yè)務(wù)時(shí)，一個(gè)常常大家被忽視的因素是總體成本和花費(fèi)的時(shí)間，主要花費(fèi)到包括試劑、抗體、培訓(xùn)、抗體組合優(yōu)化、圖像采集和數(shù)據(jù)分析上（圖三）。評(píng)價(jià)花費(fèi)是否合理的重要一點(diǎn)是每單位數(shù)據(jù)的成本（例如每個(gè)抗體染色的成本）和從多重染色中產(chǎn)生新發(fā)現(xiàn)的能力。往往一個(gè)單項(xiàng)IHC/IF實(shí)驗(yàn)可能花費(fèi)數(shù)百元，而一個(gè)50種抗體組合的多重檢測(cè)模塊可能需要數(shù)千元。導(dǎo)致多重檢測(cè)的時(shí)間和成本大幅增加的因素包括多重檢測(cè)的復(fù)雜性（抗體數(shù)量、樣本類型、樣品制備步驟等）、多個(gè)檢測(cè)循環(huán)時(shí)目標(biāo)抗原的穩(wěn)定性、在統(tǒng)一免疫標(biāo)記條件下抗體兼容性和性能，以及檢測(cè)循環(huán)中抗體組合和先后順序的設(shè)計(jì)、調(diào)整，只有在上面提到的因素都進(jìn)行最優(yōu)化處理，才能獲得最佳結(jié)果。

下游的分析是至關(guān)重要的：例如圖像定標(biāo)（例如DAPI或Hoechst 33342核染色圖像定標(biāo)）,魯棒性的細(xì)胞分割（例如核和膜染色分割）和無監(jiān)督聚類（例如基于多種生物標(biāo)志物組合染色的細(xì)胞表型分型）。梳理要囊括進(jìn)一個(gè)mIHC/mIF檢測(cè)模塊中的生物標(biāo)志物時(shí)，建議將生物標(biāo)志物按“必須有”或“最好有”進(jìn)行排序和分類，從而大大加快整個(gè)多重mIHC/mIF的開發(fā)。這些信息，連同預(yù)算和大致開發(fā)進(jìn)度表，將決定一個(gè)多重mIHC/mIF檢測(cè)模塊要包括的生物標(biāo)志物的數(shù)量。生物標(biāo)記物的選擇可以參考專家意見、現(xiàn)有文獻(xiàn)、正交數(shù)據(jù)集和/或在線資源。搞定生物標(biāo)志物目標(biāo)清單之后，下一步就是評(píng)估和購買合適的抗體。近年來，產(chǎn)生了多個(gè)抗體數(shù)據(jù)庫和搜索引擎（見系列4表），提供直觀的用戶界面。除了能發(fā)現(xiàn)高引用的抗體克隆外，這些平臺(tái)還允許研究人員查詢?cè)S多相關(guān)領(lǐng)域，如組織和細(xì)胞類型、應(yīng)用、公司和宿主物種，同時(shí)通常提供參考染色圖像。從這些資源開始往往是一個(gè)很好的開端，幫我們找到在傳統(tǒng)單IHC染色中顯示魯棒性的試劑。然而，這些數(shù)據(jù)庫往往沒有與多重mIHC/mIF檢測(cè)相關(guān)的性能細(xì)節(jié)，例如抗原穩(wěn)定性、抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)的空間位阻以及與其他抗體的兼容性。出于這些原因，我們可以提供了一份先前成功使用FF、或FFPE制備的小鼠和人體組織進(jìn)行多重免疫組化mIHC/mIF染色并得到驗(yàn)證的抗體列表，作為創(chuàng)建自定義檢測(cè)模塊的起點(diǎn)（需要請(qǐng)聯(lián)系南京泰立瑞信息）。對(duì)希望常規(guī)開展mIHC /mIF的實(shí)驗(yàn)室，我們建議以已知或已驗(yàn)證的抗體或抗體模塊及其使用先后順序?yàn)榛�礎(chǔ)，創(chuàng)建基礎(chǔ)抗體模塊，再通過添加感興趣抗體到基礎(chǔ)抗體模塊中，形成新的模塊，解決和回答新問題，這種方法減少了創(chuàng)建一個(gè)mIHC/mIF時(shí)抗體驗(yàn)證相關(guān)的時(shí)間和資金。此外，具有質(zhì)量控制措施的重組單克隆或多克隆抗體提供了最少的批間變異，使其更適合于高度復(fù)合的抗體模塊開發(fā)。還應(yīng)該優(yōu)先使用有嚴(yán)格質(zhì)控的雜交瘤衍生單克隆抗體，最后才考慮多克隆抗體。對(duì)每個(gè)供應(yīng)商的每個(gè)批次都要進(jìn)行基于特定應(yīng)用和特定樣本的測(cè)試，以確保實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性。