精性肝病(ALD）是一種常見的慢性肝病，經(jīng)常導(dǎo)致肝硬化。目前，大約75%的酒精性肝病患者是在肝硬化失代償期后被診斷出來，已經(jīng)錯(cuò)過了最佳藥物治療的時(shí)期。在早期無癥狀階段發(fā)現(xiàn)酒精性肝病可以為減緩或預(yù)防疾病進(jìn)展提供機(jī)會(huì)，但早期診斷具有挑戰(zhàn)性。肝病的準(zhǔn)確診斷需要活檢，有一定的風(fēng)險(xiǎn)，而現(xiàn)有的非侵入性生物標(biāo)志物在疾病早期的準(zhǔn)確性有限，影響了疾病的及時(shí)發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)。
 

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)的最新進(jìn)展極大地?cái)U(kuò)展了其在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究中的影響力。作者對(duì)人肝臟和血漿這兩種類型樣本進(jìn)行單獨(dú)及綜合的分析，以病理特征和疾病階段依賴性的方式系統(tǒng)地表征肝臟和血漿中的蛋白質(zhì)組變化。然后通過將機(jī)器學(xué)習(xí)，確定了用于同時(shí)檢測(cè)“顯著”纖維化（纖維化階段≥F2），輕度炎癥活動(dòng)和任何脂肪變性的生物標(biāo)志物組合。

 

本篇由德國(guó)馬普生物化學(xué)研究所Matthias Mann教授聯(lián)合Aleksander Krag教授課題組在Nature Medicine醫(yī)學(xué)一區(qū)期刊（IF:87.241）上發(fā)表的題為 “Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease”的研究成果，以人肝臟、人血漿為研究對(duì)象，采用deep高深度微量血液蛋白質(zhì)組-DIA蛋白組學(xué)分析了酒精性肝病患者和正常對(duì)照的肝和血漿蛋白組，找到了差異蛋白，然后通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法確定了三組蛋白生物標(biāo)志物組合，這些組合具有良好的診斷準(zhǔn)確性和預(yù)后能力。

 

 

研究思路

 
 

 

研究結(jié)果

 
 

 

1.患者、數(shù)據(jù)收集和研究設(shè)計(jì)

作者使用非依賴性采集（DIA）模式檢測(cè)了所有受試者的血漿蛋白以及衍生隊(duì)列中的79個(gè)肝活檢蛋白質(zhì)組，總共量化了5515種蛋白質(zhì)。

圖1 | 蛋白質(zhì)組學(xué)流程

 

2.肝臟病變對(duì)肝臟和血漿蛋白質(zhì)組的影響

肝臟蛋白質(zhì)組差異分析顯示658種蛋白在纖維化階段顯著失調(diào)，135種差異蛋白參與了炎癥活動(dòng)，以及68個(gè)差異蛋白涉及到脂肪變性。共717種獨(dú)特蛋白質(zhì)，占肝臟蛋白質(zhì)組總定量的13%（圖2a）。纖維化對(duì)肝臟蛋白質(zhì)組的影響最大，其次是炎癥。失調(diào)蛋白中，“肝臟特異性”的蛋白和注釋為“分泌”的蛋白的情況（圖2c）與之前在NAFLD和肝硬化的研究中報(bào)道的情況相似。

圖2 |  肝臟病變引起的肝臟蛋白質(zhì)組重塑

 

血漿蛋白質(zhì)組分析顯示，225個(gè)蛋白在纖維化(206個(gè)蛋白質(zhì))、炎癥活性(163個(gè)蛋白質(zhì))和脂肪變性(48個(gè)蛋白質(zhì))的組織學(xué)階段過程中豐度發(fā)生顯著變化（圖3a）。其中，隨著纖維化程度的增加，134種蛋白質(zhì)上調(diào)，91種蛋白下調(diào)（圖3b）。

圖3 | 由于肝臟病變重塑的血漿蛋白質(zhì)組

 

3.肝臟和血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的整合

總共有420種蛋白質(zhì)在肝臟和血漿中被定量（圖4a）。它們表現(xiàn)出雙峰模式，“對(duì)角線簇”上的蛋白在肝臟和血漿中中相對(duì)豐度排名在很大程度上是相關(guān)的，而“垂直簇”的蛋白則沒有相關(guān)性（圖4b）。一般來說，細(xì)胞內(nèi)酶是“垂直簇”的一部分；而對(duì)“角線簇”則包含有多種不同功能的血漿蛋白（圖4c）。

圖4 | 肝-血漿蛋白質(zhì)組的整合

 

總的來說，46種蛋白質(zhì)在肝臟和血漿蛋白質(zhì)組中共失調(diào)（圖4g）。這些代表免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附、ECM組織、蛋白酶抑制劑和細(xì)胞內(nèi)酶（圖4g）。它們可能是免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和全身炎癥增加、肝纖維化中的ECM重塑和瘢痕組織形成以及組織滲漏造成的。

 

4.用于酒精性肝病早期病理學(xué)的生物標(biāo)志物組合

作者首先比較了22個(gè)最先進(jìn)的機(jī)器學(xué)習(xí)分類器，并確定了一個(gè)邏輯回歸模型作為最終的分類器。使用“最小冗余–最大相關(guān)性”（mRMR）特征選擇算法，作者最后篩選出了由9個(gè)生物標(biāo)志物蛋白組合來識(shí)別顯著纖維化；6個(gè)蛋白組合用于識(shí)別輕度炎癥活動(dòng)以及12個(gè)蛋白的組合來識(shí)別肝脂肪變性。三個(gè)生物標(biāo)志物組合共含有22個(gè)蛋白（圖6），有7種在血漿和肝臟中均有共調(diào)節(jié)�；�于所選標(biāo)記物組的Logistic回歸模型的交叉驗(yàn)證顯示三種組合的平均ROC-AUC分別為0.90（顯著纖維化）、0.85（輕度炎癥活動(dòng)）和0.91（脂肪變性）（圖5a，d和g）。與使用廣泛的15項(xiàng)臨床模型相比，所有蛋白質(zhì)組學(xué)模型都具有最高的F1分?jǐn)?shù)和準(zhǔn)確性（圖5）；

 

圖5 | 基于血漿蛋白質(zhì)組的預(yù)測(cè)模型，用于活檢驗(yàn)證的纖維化、炎癥和脂肪變性

 

圖6 | 所選標(biāo)記面板中蛋白質(zhì)的豐度分布

 

5.在獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證模型性能

蛋白質(zhì)組學(xué)模型在健康匹配的對(duì)照隊(duì)列（n = 136）中正確排除了顯著纖維化、晚期纖維化和輕度炎癥，準(zhǔn)確率分別為99%、100和98%（圖7a）。對(duì)于有酒精濫用史且由于肝硬度低（n = 97）而未進(jìn)行活檢的患者亞組，蛋白質(zhì)組學(xué)模型分辨顯著纖維化和晚期纖維化的準(zhǔn)確性分別為93%和100%（圖7a）。在獨(dú)立的ALD驗(yàn)證隊(duì)列（n = 63）中，F(xiàn)2和I2模型的ROC-AUC分別為0.87和0.81，高于其他分類器（圖7 b和c）。

圖7 | 驗(yàn)證模型性能和評(píng)估預(yù)后能力

 

6.蛋白質(zhì)組學(xué)模型能準(zhǔn)確進(jìn)行預(yù)后測(cè)量

對(duì)丹麥的457名GALA-ALD隊(duì)列患者進(jìn)行隨訪記錄，并定義了兩個(gè)主要結(jié)局：肝臟相關(guān)事件（LREs）和全因死亡。將蛋白質(zhì)組學(xué)模型與商業(yè)性生物標(biāo)志物和肝纖維化的組織學(xué)分期進(jìn)行了比較，F(xiàn)2蛋白質(zhì)組學(xué)模型對(duì)LRE的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性最高（圖7d-f ），AUC 分別為 0.945（3年）和0.933（5年）。對(duì)于全因死亡，F(xiàn)2蛋白質(zhì)組學(xué)模型也表現(xiàn)最好，3年和5年AUC分別為0.836和0.818（圖7g-i）。

 

研究結(jié)論

酒精相關(guān)性肝病（ALD）是全球肝臟相關(guān)死亡的主要原因，但對(duì)該疾病的三個(gè)關(guān)鍵病理特征 ：纖維化、炎癥和脂肪變性的了解仍然不完整。研究者使用配對(duì)的肝-血漿蛋白質(zhì)組學(xué)方法來推斷分子病理生理學(xué)。并探索血漿蛋白質(zhì)組學(xué)在596人中的診斷和預(yù)后能力。然后使用機(jī)器學(xué)習(xí)模型確定了蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物組合，這些組合在檢測(cè)顯著纖維化和輕度炎癥上比現(xiàn)有的臨床檢測(cè)更準(zhǔn)確。此外這些生物標(biāo)志物組合在預(yù)測(cè)未來肝臟相關(guān)事件和全因死亡率方面是準(zhǔn)確的。

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使用DIA蛋白組技術(shù)檢測(cè)了人肝臟和血漿蛋白，并找到了三組蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物組合，能夠在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列以及驗(yàn)證隊(duì)列中準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后。數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent acquisition，DIA）是近年來備受關(guān)注的質(zhì)譜采集技術(shù)之一，引領(lǐng)了定量蛋白質(zhì)組新發(fā)展。