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肝糖異生失調(diào)導(dǎo)致I型和II型糖尿病的高血糖。肝糖異生被認(rèn)為是在禁食狀態(tài)下維持血糖水平的主要事件。肝臟胰島素抵抗則是這類疾病發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié), 其最明顯的病理生理特點(diǎn)就是糖異生和糖原分解功能發(fā)生紊亂導(dǎo)致肝糖輸出增多, 其中糖異生的作用尤為顯著。

 

因此, 有效抑制肝臟過(guò)度糖異生, 減少內(nèi)源性葡萄糖生成, 將是治療糖尿病的重要靶標(biāo)之一。盡管我們已經(jīng)清楚糖異生活性的調(diào)節(jié)在很大程度上依賴于轉(zhuǎn)錄水平，但是糖異生基因的轉(zhuǎn)錄激活的具體機(jī)制還未被闡明。

 

2023年3月1日，中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健研究所丁秋蓉團(tuán)隊(duì)在Molecular Cell在線發(fā)表題為Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting 的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了組蛋白磷酸化對(duì)激素信號(hào)有反應(yīng)，并將信號(hào)傳遞給染色質(zhì)以激活糖異生基因。具體而言：在饑餓狀態(tài)下，胰高血糖素激活PKA信號(hào)通路，PKA隨即被CREB招募到基因組糖異生基因調(diào)控區(qū)域，磷酸化H3S28。14-3-3ζ識(shí)別H3S28ph信號(hào)并招募RNA聚合酶II激活糖異生基因轉(zhuǎn)錄。

 

總之，作者揭示了激素信號(hào)激活的轉(zhuǎn)錄因子途徑和染色質(zhì)調(diào)節(jié)模塊之間在控制代謝穩(wěn)態(tài)中的相互作用和合作的密切性質(zhì)，為糖尿病患者治療提供了新的理論框架。

 

中文標(biāo)題： 組蛋白磷酸化結(jié)合肝臟胰島素-PKA-CREB介導(dǎo)的糖異生程序以響應(yīng)饑餓

研究對(duì)象：小鼠肝組織，肝細(xì)胞

發(fā)表期刊：Molecular Cell

影響因子：19.328

發(fā)表時(shí)間：2023.3.1

合作單位：中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所

運(yùn)用生物技術(shù)：RNA測(cè)序、CUT&Tag、ChIP-seq分析、4D-label free蛋白質(zhì)組(由鹿明生物提供技術(shù)支持)

研究思路

主要結(jié)果

1.H3S28ph可以顯著促進(jìn)肝臟糖異生基因表達(dá)和糖異生

作者首先利用多種蛋白修飾抗體確認(rèn)對(duì)禁食后組蛋白翻譯后修飾的影響，發(fā)現(xiàn)H3S28ph信號(hào)顯著增加，與肝臟CREB磷酸化的增加相當(dāng)。

圖1 | 組蛋白H3S28被磷酸化以響應(yīng)低糖信號(hào)

進(jìn)一步，作者使用RNA測(cè)序、CUT&Tag和ChIP-seq分析，以評(píng)估禁食和喂食狀態(tài)下H3S28gh的RNA圖譜和位置的全基因組變化。糖異生基因是對(duì)禁食反應(yīng)中上調(diào)最多的基因，在禁食誘導(dǎo)的基因附近可以清楚地看到H3S28ph的增加，以及葡萄糖異生基因（如G6pc、Fbp1、Pck1和Pcx）附近觀察到明顯的H3S28ph信號(hào)。這些結(jié)果表明H3S28ph是葡萄糖異生基因附近對(duì)禁食反應(yīng)的顯性激活修飾。

圖2 | 組蛋白H3S28磷酸化定位在快速誘導(dǎo)基因附近

此外，通過(guò)肝臟特異過(guò)表達(dá)野生型H3.3（wt）和H3.3S28A（S28突變?yōu)楸�氨酸以阻斷磷酸化�?/span>和H3.3S28D（S28變異為天冬氨酸以模擬磷酸化），證明H3.3-S28D可以顯著促進(jìn)肝臟糖異生基因表達(dá)和糖異生過(guò)程。

圖3 | 組蛋白H3S28磷酸化增強(qiáng)肝臟糖異生

2.14-3-3z識(shí)別H3S28ph并刺激肝臟糖異生基因轉(zhuǎn)錄

作者進(jìn)一步探究?jī)?yōu)先結(jié)合H3S28ph并介導(dǎo)基因表達(dá)激活的因素。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)鎖定核定位增加的蛋白，并結(jié)合cut-tag確定14-3-3z信號(hào)在糖異生基因的顯著富集，其分布模式與H3S28ph的信號(hào)幾乎相同。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)源性14-3-3z與肝組織中的RNA Pol II及其磷酸化形式（RNA PolⅡS5p）相互作用。

通過(guò)ChIP-qPCR糖異生基因附近的14-3-3z和RNA Pol II S5p的結(jié)合信號(hào)增加，而敲除14-3-3z后，RNA Pol II S5p富集和糖異生活性顯著降低。這證實(shí)14-3-3z結(jié)合并識(shí)別H3S28ph，招募RNA Pol II以刺激轉(zhuǎn)錄。    

3.胰高血糖素激活PKA信號(hào)通路，PKA隨即被CREB招募到基因組糖異生基因調(diào)控區(qū)域，磷酸化H3S28

先前的研究已經(jīng)建立Gcg-cAMP-PKA級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，作者繼續(xù)檢驗(yàn)Gcg-cAMP-PKA級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)H3S28ph的假設(shè)。在Gcg處理體內(nèi)肝組織和體外原代肝細(xì)胞后，均觀察到H3S28ph信號(hào)的顯著增加。體外激酶測(cè)定表面增加PKA時(shí)，H3S28ph也顯著增加。

當(dāng)作者敲除PKA的催化亞基α時(shí)，糖異生活性下調(diào)，而H3.3S28D的表達(dá)可以顯著恢復(fù)PKA缺失肝細(xì)胞中的葡萄糖生成和糖異生基因表達(dá)。這證實(shí)PKA磷酸化H3S28以響應(yīng)禁食。

圖4 | 14-3-3z讀取H3S28ph

 

那什么決定了H3S28ph在葡萄糖異生基因上對(duì)禁食的特異性呢？作者發(fā)現(xiàn)H3S28ph結(jié)合了豐富的CRE基序，而CREB先前被鑒定為通過(guò)與CRE結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)糖異生基因轉(zhuǎn)錄的核心轉(zhuǎn)錄因子。在CREB耗盡的肝臟中，由于禁食，H3S28ph顯著降低，PKA和H3之間的相互作用降低，有力地證明了CREB參與PKA的基因組募。

圖5 | PKA磷酸化H3S28并通過(guò)H3S28磷酸化調(diào)節(jié)糖異生

 

4.PP2A作為H3S28ph的磷酸酶

先前研究表明PKA和PP2A（絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶）具有相似的識(shí)別基序和底物蛋白。為了檢查PP2A是否是H3S28ph的磷酸酶，作者通過(guò)體外磷酸酶測(cè)定，和CUT&Tag分析證實(shí)PP2A抑制H3S28ph磷酸化。進(jìn)一步地，肝臟PP2A耗竭阻止了H3S28ph對(duì)葡萄糖注射的去磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)糖異生活性增加和H3S28ph、14-3-3z和RNA Pol II S5p信號(hào)在糖異生基因啟動(dòng)子處的富集顯著增加。這些數(shù)據(jù)共同闡明了PP2A是抑制糖異生基因表達(dá)的H3S28ph磷酸酶。

圖6 | CREB指導(dǎo)糖異生基因的H3S28磷酸化

 

研究結(jié)論

饑餓狀態(tài)下，胰高血糖素激活PKA信號(hào)通路，PKA隨即被CREB招募到基因組糖異生基因調(diào)控區(qū)域，磷酸化H3S28。14-3-3ζ識(shí)別H3S28ph信號(hào)并招募RNA聚合酶II激活糖異生基因轉(zhuǎn)錄。

而進(jìn)食狀態(tài)下，PP2A作為H3S28ph的磷酸酶抑制其磷酸化，繼而抑制糖異生基因的表達(dá)。PKA和PP2A通過(guò)組蛋白磷酸化/去磷酸化參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達(dá)，也可能對(duì)其他生物過(guò)程產(chǎn)生廣泛的功能影響。

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