流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，簡(jiǎn)稱FCM）是一種基于流式細(xì)胞儀通過檢測(cè)偶聯(lián)熒光信號(hào)快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞或者顆粒）的多項(xiàng)特性技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體進(jìn)行分選。早期流式細(xì)胞術(shù)主要用于定性，后續(xù)慢慢發(fā)展為多參數(shù)定性、定量以及分選的技術(shù)。

研究對(duì)象：

顆粒性物質(zhì)，如大量的臨床樣本、外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、洗脫液以及各種培養(yǎng)細(xì)胞、藻類、原生動(dòng)物、病毒等生物性顆粒及人工合成微球等物理顆粒。

研究目的：

通過流式分析研究顆粒性物質(zhì)的特性，包括多種物理及生物學(xué)特征；通過利用不同熒光素標(biāo)記不同組分將目的細(xì)胞與非目的細(xì)胞區(qū)分開來，從而獲得純度更高的目的細(xì)胞群并研究其物理及生物學(xué)特性。

技術(shù)特點(diǎn)：

1.檢測(cè)速度快；

2.準(zhǔn)確性好；

3.精確度高；

4.細(xì)胞不被破壞；

5.靈敏度高；

6.可進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)；

7.不單限于表面抗原，可根據(jù)發(fā)光度（如細(xì)胞體積）或熒光散射度（如DNA、RNA或蛋白含量、酶活性、特異抗原）來分離細(xì)胞。

流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展

流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)60年代后期開始發(fā)展起來的，流式細(xì)胞儀通過接受激光照射液流入細(xì)胞后的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)反應(yīng)細(xì)胞的物理化學(xué)特征，如細(xì)胞大小、顆粒度和抗原分子的表達(dá)情況等。主要應(yīng)用于生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究，尤其是免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)。80年代后期開始應(yīng)用于臨床，輔助多種疾病的診斷，尤其是白血病的診斷和分型。隨后，利用流式分選干細(xì)胞過繼回輸用于疾病治療，如NK細(xì)胞回輸提高免疫力，CIK治療等。

隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了多種型號(hào)的流式分析儀、分選儀，同時(shí)隨著配備的激光器的不斷升級(jí)，有些流式分析儀可進(jìn)行多達(dá)10色以上的熒光分析。流式分析軟件的不斷優(yōu)化，使得流式結(jié)果分析變得更加快速、便捷，并能簡(jiǎn)單獲得多形式的流式分析示圖，極大地豐富了生物學(xué)檢測(cè)分析應(yīng)用領(lǐng)域。這一集多個(gè)學(xué)科的智慧于一身，將計(jì)算機(jī)、電子工程、光學(xué)、流體力學(xué)、數(shù)學(xué)及有機(jī)化學(xué)等多學(xué)科巧妙地融合起來而誕生的流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，具有重大應(yīng)用價(jià)值。

流式細(xì)胞術(shù)的3大要素：

01流式細(xì)胞儀

盡管市面上有不同品牌的流式細(xì)胞儀，例如BD,Beckman coulter,Partec,Miltenyi,Agilent,Thermo等等，但其主要構(gòu)成不外乎液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)。

（1）液流系統(tǒng)

（2）光路系統(tǒng)

光路系統(tǒng)即我們常說的激光器，根據(jù)其發(fā)射激光波長(zhǎng)來分，如常見488nm藍(lán)激光器、635nm的紅激光器和405nm的紫激光器，由激光器發(fā)出的激光照射到細(xì)胞后其產(chǎn)生的光信號(hào)會(huì)經(jīng)過不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收。這些光信號(hào)包括散射光和熒光信號(hào)，F(xiàn)SC（散射光信號(hào)，用于量化反應(yīng)細(xì)胞的大小）、SSC（側(cè)向散射光，用于量化反應(yīng)細(xì)胞的復(fù)雜程度），這些熒光信號(hào)來源于細(xì)胞上偶聯(lián)的熒光素，被激光激發(fā)后，會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)。

（3）檢測(cè)分析系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的檢測(cè)分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細(xì)胞的各個(gè)通道的光信號(hào)匯總分析，最終歸類樣本群體中的細(xì)胞物理化學(xué)特征。

通道，即光電倍增管，其主要作用為：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?hào)；放大電子信號(hào)；分為散射光通道（FSC通道、SSC通道）以及熒光通道。一個(gè)激光器可以有多個(gè)熒光通道，一個(gè)通道可以對(duì)應(yīng)多個(gè)熒光染料。

02樣品細(xì)胞

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)象包括細(xì)胞和組織，但是無論細(xì)胞或者組織，最終制備上樣的樣品均需要為單細(xì)胞懸液。這是由于細(xì)胞或者組織團(tuán)塊以及碎片容易堵塞進(jìn)樣管。

03熒光偶聯(lián)抗體

由于樣本細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)弱是根據(jù)標(biāo)記在其表面的熒光素被激光照射后激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱來判斷的，所以樣本細(xì)胞必須標(biāo)記偶聯(lián)熒光素抗體。

常見的流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用

1.細(xì)胞群比例測(cè)定以及表型測(cè)定

運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定某細(xì)胞群體或者細(xì)胞亞群的比例是其最基本功能。要完成細(xì)胞群比例測(cè)定我們需要明確：要測(cè)定的總體是什么，例如免疫細(xì)胞的特征表型是CD45,T細(xì)胞的特征表型是CD3，由此我們可以得到一群CD45+CD3+或者CD45+CD3-細(xì)胞，同理我們也可以對(duì)得到的這群細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步劃分，最終得到我們的目標(biāo)細(xì)胞群比例測(cè)定或者是表型測(cè)定。

2.細(xì)胞表面分子、胞內(nèi)抗原的檢測(cè)與分析

選擇與熒光素偶聯(lián)的抗體或使用一抗和與熒光素偶聯(lián)的二抗，通過抗原抗體結(jié)合原理，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)細(xì)胞表面分子、胞內(nèi)抗原表達(dá)量的目的，并可以作為一種抗體開發(fā)質(zhì)控檢測(cè)手段。

3.細(xì)胞DNA倍體與周期檢測(cè)與分析

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段，是細(xì)胞從2倍體到4倍體再分裂成2倍體的過程。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料�？梢耘cDNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0，S和G2/M三期，從而可通過流式直方圖對(duì)各時(shí)相細(xì)胞百分率進(jìn)行分析。

4.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析Annexinv/PI雙染法

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，可快速準(zhǔn)確的得到細(xì)胞處于早期、晚期凋亡的細(xì)胞比例，反映藥物處理對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響。

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信，建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。

Q2:(AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI--，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

5

流式分選術(shù)應(yīng)用的運(yùn)用解決了細(xì)胞學(xué)研究中一個(gè)很重要的課題分離純化，尤其是需要研究細(xì)胞功能時(shí)，如收集細(xì)胞培養(yǎng)上清通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞的功能等，都需要得到高純度的細(xì)胞。

多重?zé)晒鈽?biāo)記的流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測(cè)小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量流式細(xì)胞術(shù)展望

流式細(xì)胞術(shù)以其速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，在學(xué)術(shù)研究、臨床治療等方面具有廣泛應(yīng)用前景，并獲得越來越多的學(xué)術(shù)研究者及醫(yī)藥工作者的青睞。流式細(xì)胞儀也隨科技的進(jìn)步向小型化、微型化、多重?zé)晒夥治龇较虬l(fā)展，分析靈敏度和準(zhǔn)確性也明顯提高。隨著生物醫(yī)藥的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用幾乎涵蓋了整個(gè)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，將來也必然在學(xué)術(shù)研究、臨床免疫學(xué)、臨床血液腫瘤學(xué)、臨床微生物學(xué)應(yīng)用、細(xì)胞分選等方面得到更廣泛的應(yīng)用。