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2022年9月，復旦大學生命科學學院丁琛團隊、復旦大學附屬中山醫(yī)院侯英勇團隊、復旦大學附屬中山醫(yī)院沈坤堂、復旦大學附屬中山醫(yī)院劉天舒團隊和上海交通大學附屬新華醫(yī)院趙健元團隊在《Nature Communications》期刊(IF=17.694)發(fā)表的題為“ Proteomic characterization of gastric cancer response to chemotherapy and targeted therapy reveals potential therapeutic strategies”的研究成果，本研究通過分析了206個來自接受化療或抗her2治療的胃癌患者的腫瘤組織的蛋白質(zhì)組。

 

本研究基于蛋白質(zhì)組學的胃癌一線治療預測分類器的構(gòu)建和驗證，在一定程度上有助于個性化化療和靶向治療，從而走向蛋白質(zhì)組學驅(qū)動的精準醫(yī)療時代。

 

更重要的是，本研究提出了一種全面的蛋白質(zhì)組學方法來預測對化療和靶向治療的反應，提出CTSE聯(lián)合TKTL1可以促進更有效的臨床決策，以確定基于doc的治療對患者的相對益處，暗示了其預后和治療意義以及可能有益于臨床實踐的潛在調(diào)節(jié)機制，并為研究胃癌化療和靶向治療的機制和指標提供了豐富的資源。

 

研究背景

 

胃癌（GC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的第二大原因。胃癌的危險因素包括吸煙、高鹽飲食、高肉類攝入量、膽汁反流和幽門螺桿菌感染等。目前，手術(shù)、化療和放療是胃癌的主要治療策略。

 

術(shù)前化療被認為是一種標準的治療方法，也是提高局部晚期GC患者生存率的一種很有前途的方法。

 

三聯(lián)化療DOS（多西紫杉醇、奧沙利鉑和S-1）和雙重化療XELOX（卡培他濱和奧沙利鉑）已被確定為治療局部和轉(zhuǎn)移性胃癌的一線治療方法。

 

最近的幾項第二階段的研究和最近的證據(jù)表明曲妥珠單抗與一系列治療模式的聯(lián)合使用已經(jīng)支持了曲妥珠單抗+ XELOX治療her2陽性晚期GC8-11患者的有效性和安全性。

 

然而，與曲妥珠單抗+ XELOX相比，曲妥珠單抗+ DOS聯(lián)合治療效果較差，中位OS更短，這尚未在臨床中廣泛應用，曲妥珠單抗聯(lián)合化療的耐藥機制尚不清楚。

研究思路

 

研究方法

1. 非標記定量蛋白質(zhì)組

2. MSI/MSS特性的評價

3. 單樣本基因集富集分析（ssGSEA）

4. 目標PRM分析

5. 質(zhì)粒構(gòu)建

6. 慢病毒的產(chǎn)生和細胞轉(zhuǎn)導

7. 蛋白質(zhì)印跡法

8. 增殖試驗

9. 免疫細胞化學和免疫熒光法

 

研究結(jié)果

1.胃癌患者對化療和靶向治療的反應

 

為了研究與化療和靶向治療反應相關的蛋白質(zhì)組學模式，作者收集了206例化療初期的胃癌患者的腫瘤組織，利用福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE），隨后通過基于質(zhì)譜（MS）的標簽進行分析自由量化策略（圖1a），詳細的臨床特征見圖1b。

 

生存分析顯示，敏感組（S，N = 79)的生存率高于非敏感組（NS，N = 97）（圖1c）。蛋白質(zhì)組學檢測結(jié)果顯示，每個樣本中有6369-8119個基因產(chǎn)物（GPs）(圖1d）。S（11258個GPs）和NS（11388個GPs）之間的蛋白質(zhì)組學覆蓋率沒有顯著差異（圖1e）。

圖1| 胃癌的蛋白質(zhì)組學分析綜述

 

2.GC隊列的蛋白質(zhì)組學分型及其與治療反應的關系

 

作者對179個樣本的蛋白質(zhì)組譜進行共識聚類分析，發(fā)現(xiàn)4種GCs蛋白質(zhì)組亞型，其中28、56、75和20例患者分別分為G-I、G-II、G-III和G-II亞型（圖2a），非敏感患者（SD和PD）的百分比從G-I的40%增加到G-IV的80%(圖2b），在4個亞型中，G-IV的預后最差（log rank檢驗，P<0.05）（圖2c）。

 

此外，作者確定了蛋白質(zhì)組亞型與治療亞隊列或TNM分期之間存在明顯的關聯(lián)，但這種關聯(lián)與分級、勞倫類型、原發(fā)部位或腫瘤純度均未觀察到（圖2b）。在G-II亞型中，我們觀察到糖酵解/糖異生和泛酸/輔酶a生物合成顯著富集（Fig. 2d）。

 

為了研究蛋白表達與治療耐藥性的相關性，作者使用來自癌癥依賴圖譜項目（DepMap）的胃癌細胞系數(shù)據(jù)，分析了G-IV亞型中藥物敏感性顯著上調(diào)的細胞外基質(zhì)蛋白與藥物依賴性的相關性。作者鑒定了5個蛋白，包括THSD4、SRPX2、TGFBI、THBS1和LAMB2，它們與藥物反應（5-FU、奧沙利鉑或多西紫杉醇）高度相關（圖2e）。

 

作者觀察到過表達thsd4的MKN45細胞中多西紫杉醇、奧沙利鉑和5-FU的半抑制濃度值顯著高于空載體細胞（圖2f）。

圖2| 胃癌隊列的蛋白質(zhì)組學分型及其與臨床特征的關系

 

3.胃癌的MSS/MSI狀態(tài)與腫瘤免疫微環(huán)境和治療耐藥性相關

 

為了進一步檢驗復旦GC隊列（FDGC）的蛋白質(zhì)組學分型算法在其他GC隊列中是否可行，作者將相同的FDGC分型算法應用于三個獨立的胃癌患者隊列，觀察到FDGC亞型和EOGC亞型或ACRG亞型，但不是FDGC亞型和BPRC亞型（圖3a，b），這可能是由于FDGC亞型和EOGC亞型或ACRG亞型之間的成分相似，而BPRC隊列只包括彌漫型癌癥。

 

在ACRG隊列和FDGC隊列中，低MSI/MSS-sig與較差的臨床結(jié)果顯著相關（圖3d），這與之前的研究一致。

 

此外，MSI/MSS-sig高的胃癌具有氧化磷酸化特征，而MSI/MSS-sig低的胃癌具有細胞外基質(zhì)蛋白的高表達（圖3e）。G-IV亞型中一組細胞因子、參與抗原加工的蛋白和MHCII類分子的持續(xù)下調(diào)（Fig. 3f）。與巨噬細胞M1相比，前體單核細胞聚集在G-IV亞型中（圖3g，h）。

圖3| FDGC分型算法在多個獨立隊列中的應用\以及MSI/MSS特征與臨床結(jié)果的相關性

 

進一步分析表明，MSI/MSS-sig與單核細胞和巨噬細胞M1顯著相關（圖3i），對四種蛋白質(zhì)組亞型間顯著差異細胞類型的生存分析顯示，IV期患者單核/巨噬細胞M1的xCell評分與預后顯著相關，而不是II期和III期（圖3j），同樣，這些結(jié)果也在獨立的ACRG隊列中得到了驗證（圖3j）。

此外，巨噬細胞M1在MSI高組中HLA-DRA的生物標志物HLA-DRB3和IL18在MSI/ MSS-sig高組顯著增加（圖3k）。IL18的高表達也反映了與IV期患者的預后顯著相關（圖3l）。

總的來說，微衛(wèi)星穩(wěn)定的腫瘤細胞聚集和巨噬細胞少的M1容易耐藥，預后較差（圖3m）。

 

4.T細胞受體信號通路在DOS和XELOX化療中發(fā)揮不同的作用

 

生存分析也表明，MSI-sig高水平的胃癌患者與DOS治療中的總生存期呈正相關，而沒有觀察到MSI/MSS-sig水平與XELOX治療的臨床結(jié)果之間的差異（圖4a）。根據(jù)圖4b所示的KEGG通路注釋，對每組過多的蛋白進行通路富集。

 

相反，在XELOX亞隊列中，TCR信號通路為在XNSG中富集，高表達代表預后不良（圖4c)。同時，TCR通路、GSEA分析顯示，TCR信號通路是在XELOX非敏感患者中富集的基因信號通路，在DSG中有效，該通路的高激活在接受XELOX治療的BPRC隊列中表現(xiàn)更好（圖4d）。

 

CD8 + Tcm、CD8+t細胞和cDC在XNSG中富集（圖4e）。在BPRC隊列中，XELOX等免疫效應細胞也在XELOX非敏感患者中富集（圖4f）。

 

值得注意的是，在31種抗癌藥物中，多西紫杉醇的ICD成分排名前一名，表明多西紫杉醇誘導免疫原性細胞死亡的能力更高（圖4g）。在DSG和XNSG中發(fā)現(xiàn)的1099個蛋白的比例較高，這些蛋白參與了免疫調(diào)節(jié)和ERBB通路（圖4h）。

 

圖4| 敏感組和非敏感組治療亞隊列中蛋白和信號通路的差異表達

 

如圖4i所示，單變量cox分析確定了參與免疫調(diào)節(jié)的12種蛋白和ERBB信號通路在DOS亞隊列中與無病生存（DFS）呈正相關，而在XELOX亞隊列中呈負相關。NCI-N87細胞中XELOX和TRA的半抑制濃度值分別為36.6 μM和43.7μM（圖4j）。GSEA分析還顯示，TCR信號在XHSG中富集（P = 0.033），并與臨床結(jié)果呈正相關（圖4k）。xCell分析顯示，XHSG中CD4+t細胞、CD4 + Tcm、CD8 + Tcm等免疫細胞的豐度顯著增加（圖4l）。XNSG中CD4陽性細胞和CD8陽性細胞的比例高于XSG中（圖4m）。

 

綜上所述，曲妥珠單抗與XELOX聯(lián)合治療可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，TCR信號通路和CD8 + Tcm成為聯(lián)合治療的良好反應標志物（圖4n）。

 

 

5.ECM/PI3K-AKT通路的激活與抗her2靶向治療的耐藥性相關

 

作者重點關注HER2亞隊列，并將該亞隊列分為HER2敏感組（HSG）和非敏感組（HNSG）。HSG與HNSG之間的OS和PFS的預后有顯著性差異（圖5a）。Cox分析提示，ERBB2不能被認為是HER2亞隊列中獨立的預后因素。這些結(jié)果反映了HER2表達水平與曲妥珠單抗耐藥性的低相關性（圖5b）。

 

KEGG通路富集分析顯示，HNSG具有ecm-受體相互作用、PI3K-AKT通路等特征。（圖5c、d）。此外，ECM與臨床結(jié)果呈負相關（圖5e），ECM蛋白如COL4A1、COL6A5、FN1、GP1BA、ITGA4、THBS3和THBS4在曲妥珠單抗耐藥細胞系47中也有過多的比例（圖5f）。PI3K-AKT信號通路與ecm-受體相互作用通路的正相關性最高（圖5g）。

 

HNSG中凋亡相關蛋白，包括BCL2、BCL2L1、CASP3、CASP7和CDKN2A的下調(diào)（圖5h）。NCI-N87細胞中BUP和TRA的半抑制濃度值分別為8.19 μM和46.57μM（圖5i）。

 

綜上所述，ECM可激活PI3K-AKT通路，抑制細胞凋亡，從而削弱曲妥珠單抗的抗腫瘤作用（圖5j）。

圖5| HSG/ HNSG中蛋白和信號通路的差異表達

 

6.胃癌化療及靶向治療預測模型的構(gòu)建與驗證

 

作者比較確定s-過度代表和ns-過度代表的蛋白質(zhì)組是否可以區(qū)分敏感GC患者和非敏感GC患者對DOS治療、XELOX治療、抗her2治療或聯(lián)合化療的反應（圖6a）。通過對訓練集進行了10倍交叉驗證，獲得了3個預測模型，其具有高靈敏度和特異性的預測模型（圖6b）。此外，熱圖顯示，在新的獨立隊列中，DSG與DNSG、XSG和XNSG、HSG和HNSG之間分別有明顯的分離（圖6c）。

圖6| 預測性分類器的構(gòu)建與驗證

 

7.過表達CTSE通過穩(wěn)定微管協(xié)同提高了對多西紫杉醇的敏感性

 

與細胞轉(zhuǎn)染一個空載體，CTSE過表達顯著促進MKN45和MGC803細胞的增殖（圖7a，b）,CTSE過表達組的半抑制濃度值（圖. 7c），而XELOX無明顯變化（圖7d），CTSE過表達組的DOC半抑制濃度值低于對照組（圖7e）。

 

對未經(jīng)處理的CTSE過表達和對照MKN45細胞的差異蛋白質(zhì)組學分析顯示，971個上調(diào)的GPs在基礎轉(zhuǎn)錄因子中富集。進一步的差異蛋白質(zhì)組學分析表明，CTSE過表達使MKN45細胞容易發(fā)生壞死，這表明CTSE對DOC有積極的反應（圖7g）。

 

通過免疫印跡分析，驗證CTSE組的DOC暴露降低了可溶性α-和β-微管蛋白亞基的含量，表明微管蛋白向微管的聚合增強，從而提高了DOC的敏感性（圖7h）。

 

8.過表達TKTL1，通過誘導異常的染色體分離，降低了對多西紫杉醇的敏感性

 

TKTL1的過表達促進了MKN45和MGC803細胞系的細胞增殖（圖7i，j）。通過比較TKTL1過表達細胞和對照細胞對DOS和XELOX的敏感性，發(fā)現(xiàn)TKTL1過表達細胞，而XELOX沒有顯著變化（圖7k，l）。過表達TKTL1組DOC的半抑制濃度值高于對照組（圖7m）。

 

在doc處理的tktl1過表達細胞中觀察到嚴重的異常染色體分離表型，包括染色體錯位、多極和滯后染色體（圖7n）。與doc處理的對照組細胞相比，在doc處理的tktl1過表達細胞中觀察到非整倍體性增加（圖7o）。

 

在該模型中，CTSE通過微管穩(wěn)定作用作為DOC化學敏感性的細胞內(nèi)在增強劑，而TKTL1通過誘導異常染色體分離作為衰減劑（圖7p）。

圖7| 過表達CTSE和TKTL1過表達對胃癌細胞系MKN45和

MGC803中DOS和XELOX抗癌活性的影響

 

研究解讀

1. 構(gòu)建了一個涵蓋三個臨床治療亞隊列的胃癌隊列，包括DOS亞隊列（44例接受DOS治療）、XELOX亞隊列（70例接受XELOX治療）和HER2亞隊列（71例接受抗HER2治療的患者）。

2. 蛋白質(zhì)組學聚類的結(jié)果是四種具有不同功能的GC分子亞型，顯示出與藥物反應和臨床結(jié)果相關。

3. 在其他獨立的胃癌隊列中驗證了胃癌分型及其預后差異。

4. MSI-sig高狀態(tài)的胃癌患者對DOS治療反應敏感，而對XELOX治療反應不敏感。

5. 曲妥珠單抗與XELOX或PI3K-AKT抑制劑的體外協(xié)同作用。

6. 開發(fā)了具有高精度的預后模型來預測化療反應，在60例GC患者(XELOX（N=20）、XELOX（N = 20）、XELOX（N = 20）或抗her2（N=20）治療。

7. CTSE作為多西紫杉醇化學敏感性的細胞內(nèi)在增強劑，而TKTL1作為多西紫杉醇的衰減劑。