2023年2月5日，同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院張子強團隊在Gut Microbes（IF= 9.434）在線發(fā)表了腫瘤微生態(tài)調(diào)控的最新研究成果“Microbiome and spatially resolved metabolomics analysis reveal the anticancer role of gut Akkermansia muciniphila by crosstalk with intratumoral microbiota and reprogramming tumoral metabolism in mice”。該研究通過微生態(tài)組學(xué)及AFADESI空間代謝組學(xué)等多個層面的研究，首次發(fā)現(xiàn)了腸道菌群和肺癌微生態(tài)之間潛在的全新調(diào)控作用，闡明了腸道/腫瘤菌群交互作用以及菌群參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制。其中AFADESI空間代謝組學(xué)由鹿明生物提供技術(shù)支持；

研究背景

本研究的前提有如下幾點：

1.腸道菌群對腫瘤生物學(xué)有深遠影響，比如口服雙歧桿菌（Bifidobacterium）會增強PD-L1的治療效果；

2.腫瘤組織內(nèi)部也有微生物存在，稱為瘤內(nèi)菌群。它可能會調(diào)節(jié)癌癥進展并影響治療。但其具體影響很大部分還是未知的。

3.研究表明，腸道菌群中的梭菌（Clostridiales）可能有助于降低小鼠結(jié)直腸癌的尺寸，其效果取決于瘤內(nèi)浸潤以及隨后的CD8+T細胞的激活。但目前對腸道菌群和瘤內(nèi)菌群之間的關(guān)系，以及二者與腫瘤的相互作用還不清楚。

4. Akkermansia muciniphila（Akk）據(jù)研究對腫瘤和其他疾病具有有益作用，但機制不清楚。

 

因此，作者從空間分布的分子水平角度，通過Akk灌胃處理肺癌小鼠模型，研究了Akk對瘤內(nèi)菌群轉(zhuǎn)位及影響。

 

研究思路

 

 

·腸道Akkermansia muciniphila 抑制Lewis肺癌小鼠模型中的腫瘤生長

 

 

 

圖1 |  肺癌小鼠模型中的腸道微生物群落和多樣性分析

 

首先為了確定內(nèi)源性腸道微生物群與肺癌腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系，作者使用了總共108只小鼠建立肺癌模型（樣本策略）。并根據(jù)腫瘤生長情況，將小鼠分為普通腫瘤組（group1，n = 92），腫瘤延遲發(fā)育組（group2a，n = 16）以及無腫瘤發(fā)生組（group2b，n = 10）（圖1a）。為了確定兩組（group1和group2）之間腸道微生物群的分類組成和微生物多樣性的差異，作者進行了α和β多樣性分析。發(fā)現(xiàn)，group1的OTU（Operational Taxonomic Unit）豐度比group2高（圖S1a）。

 

然而，反映物種豐富度和均勻度的Shannon和Simpson指數(shù)在group1和group2之間沒有顯著差異（圖S1-c）。通過使用β多樣性分析生成加權(quán)的UniFrac主坐標(biāo)分析（PCoA），并顯示了第1組和第2組之間的聚類情況（圖1b）。發(fā)現(xiàn)，與普通腫瘤發(fā)生小鼠（group1）相比，延遲腫瘤發(fā)生小鼠（group2a）或無腫瘤發(fā)生小鼠（group2b）的腸道Akk（屬于Verrucomicrobiales）和雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）明顯升高（圖1e）。這提示腸道菌群中的Akk和雙歧桿菌可能對腫瘤生長有影響。因此作者接下來探究了Akk灌胃對腫瘤的影響。發(fā)現(xiàn)，灌胃Akk明顯抑制了腫瘤的增殖，而Akk灌胃組和Akk+雙歧桿菌灌胃組之間沒有明顯差異（圖1f）。

 

·通過AFADESI-MSI方法進行空間分辨率代謝組學(xué)的代謝物分析

接下來，作者使用AFADESI空間代謝組對Akk對腫瘤的影響展開研究（圖2a）。首先作者根據(jù)解剖學(xué)特征將樣本分為三種區(qū)域：非壞死區(qū)、副壞死區(qū)和壞死區(qū)，同時，空間代謝組的聚類分析也清楚地顯示出這些區(qū)域（圖2b,c）。空間代謝組檢測到的乳酸（圖2d）和代謝（圖2e）的分布與組織學(xué)分區(qū)高度一致。

圖2 | 肺癌小鼠模型腫瘤切片中的代謝物分析

 

·Akk灌胃對腫瘤代謝的影響：映射出特定區(qū)域的代謝網(wǎng)絡(luò)

接下來，作者通過將空間代謝組成像圖與HE染色結(jié)果疊加，將這三個分區(qū)進行了選區(qū)比較分析，構(gòu)建了一個代謝網(wǎng)絡(luò)。確定了受影響的代謝通路，發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝、谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、中心碳代謝、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、丙酮酸代謝、糖酵解/葡萄糖生成、嘧啶代謝和脂肪酸生物合成等代謝通路在腫瘤組織中受到Akk灌胃的顯著影響（圖3c-e）。這些代謝通路之間存在密切聯(lián)系，如谷氨酰胺代謝、嘌呤和嘧啶代謝、糖酵解代謝和谷胱甘肽代謝（圖3f）。

圖3 | 區(qū)域特異性代謝網(wǎng)絡(luò)

 

·Akk灌胃對腫瘤代謝的影響：Akk調(diào)控糖酵解代謝

通過研究糖酵解途徑的代謝物乳酸發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中糖代謝失調(diào)，即乳酸的離子強度在整個腫瘤區(qū)域高度表達（圖4a-e）。而灌胃Akk可以極大地降低了不同解剖學(xué)上的癌癥亞區(qū)的乳酸水平（圖4c）。IHC實驗發(fā)現(xiàn)，作為調(diào)節(jié)糖代謝的酶，LDHA在癌區(qū)也是高度表達的，而Akk處理后則顯著降低（圖4f）。

圖4 | 糖酵解代謝途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位可視化

 

·Akk灌胃對腫瘤代謝的影響：Akk調(diào)控谷氨酰胺代謝

據(jù)研究，谷氨酰胺（glutamine，Gln）會顯著富集于癌區(qū)。在本項研究中，作者發(fā)現(xiàn)，Gln的代謝在肺癌組織中明顯失調(diào)，Glu、天冬氨酸、琥珀酸和蘋果酸作為Gln的水解產(chǎn)物，在肺癌組織中急劇增加，然而，它們在Akk組明顯下調(diào)（圖5a，b）。這可能與谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）介導(dǎo)的谷氨酸（glutamate，Glu）水解有關(guān)，IHC實驗發(fā)現(xiàn)，GLS在癌癥組織中明顯上調(diào)，而在Akk組中則明顯下調(diào)（圖5c），這與Glu的成像圖很一致。

圖5 | 谷氨酰胺代謝途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位可視化

 

·Akk灌胃對腫瘤代謝的影響：Akk調(diào)控嘌呤和嘧啶代謝

核苷酸的合成可以通過各種代謝途徑來調(diào)節(jié)，這些核苷酸是維持癌細胞快速增殖的必要營養(yǎng)物質(zhì)。其中一個機制是通過加強糖代謝或Gln代謝來產(chǎn)生更多核苷酸合成所需的分子前體。MSI分析表明，核苷酸生物合成，如AMP、ADP、GMP和UMP，在對照組小鼠的肺癌中明顯表達（圖6a），同時核苷酸生物合成在Akk組的癌癥組織中急劇下調(diào)（圖6b）。

圖6 | 通過關(guān)鍵代謝物的原位可視化和定量分析確定，灌胃Akk可下調(diào)核苷酸生物合成代謝

 

·Akk灌胃對腸道菌群的影響

另一方面，Akk灌胃后也可能會對腸道菌群組成造成影響。接下來，作者通過16S DNA測序分析了腸道菌群，發(fā)現(xiàn)，對照組和Akk組小鼠的腸道菌群組成沒有明顯差異（圖7a-c），二者共有的OTU有1988個（圖7e）。為了確定與Akk相關(guān)的特定微生物群落，進一步分析發(fā)現(xiàn)，在屬的水平上，發(fā)現(xiàn)Akk的豐度在Akk灌胃小鼠的腸道微生物群中升高，而在對照組小鼠的腸道微生物群中，腸桿菌（Enterobacterales）、螺旋桿菌（Helicobacter）、類桿菌（Bacteroidota）的豐度增加（圖7f）。

 

圖7 | Akk灌胃后對小鼠腸道菌群的影響

 

·Akk灌胃對腫瘤菌群的影響

本文之前的研究發(fā)現(xiàn)，Akk灌胃后會對肺癌及腸道菌群組成造成一定影響，那它是否也會影響瘤內(nèi)菌群。為解決這個問題，作者同樣用16s DNA測序分析了瘤內(nèi)菌群。發(fā)現(xiàn)對照組和Akk組的菌群組成沒有明顯差異（圖8a），二者共有278個OTU（圖8c）。通過LEFSe分析，作者發(fā)現(xiàn)，在門類水平上，Akk灌胃組腫瘤中Bradyrhizobium、Vibrionimonas Verrucomicrobiales和Lactobacilius的豐度增加，而Gammaproteobacteria、Sphingomonadales和Acidobacteriae的豐度則在對照組中富集（圖8d-e）。Akk組腫瘤組織中Akk的豐度升高了（圖8d-8f）。

 

此外，為了比較不同樣品的微生物組成，作者又設(shè)立了5個組，分別是Lewis肺癌細胞（Cell），對照組小鼠的糞便樣品（CFA），對照組小鼠的腫瘤組織樣品（CT），Akk灌胃小鼠的糞便樣品（AFA），Akk灌胃小鼠的腫瘤組織樣品（AT）。作者比較和分析了這些組中富集的前100個微生物群。如圖S7a所示，與腸道微生物群的組成不同，腫瘤組織中的主要微生物群，如Staphylococcus、Vibrionimonas、Bacillus和Rhodanobacter在腸道中并不明顯。通過進一步比較CT、AT和Cell組中瘤內(nèi)菌群，發(fā)現(xiàn)與Lewis細胞樣本相比，Akk灌胃小鼠腫瘤組織中的Akkermansia、Lactobacillus、Bifidobacterium、Staphylococcus和Bacteroides（用紅色箭頭條標(biāo)記）都明顯增加。另一方面，這些常見的腸道微生物群在用于肺癌小鼠模型的Lewis細胞系中未被檢測到。這些結(jié)果表明，腫瘤微生物群包含更多的Akk和其他"腸道微生物"，它們可能來自于腸道。

圖8 | Akk灌胃后對肺癌小鼠模型瘤內(nèi)微生物組的影響

 

·腸道和腫瘤微生物群之間的相互作用:腸道細菌可能通過體循環(huán)進入肺癌組織

上面的結(jié)果提到，腸道Akk和瘤內(nèi)微生物群之間的正相關(guān)關(guān)系表明，可能存在腸道細菌向癌癥組織的潛在轉(zhuǎn)移。因此，作者想探究這種轉(zhuǎn)移是否是通過血液循環(huán)。通過對血液進行16s DNA測序，作者發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)級，灌胃細菌的小鼠血樣中Verrucomicrobia（Akk屬于Verrucomicrobia）和Bifidobacteriaceae的豐度增加（圖9a，b）。在屬的層面上，灌胃后2小時，在血液中Akk和雙歧桿菌豐度出現(xiàn)升高，而6小時后，不能明顯檢測到Akk或雙歧桿菌（圖9c）。

 

圖9 | 血液循環(huán)中腸道細菌的檢測（對照組（CB），Akk灌胃組（AB））

 

·差異腫瘤微生物群和差異代謝物之間的關(guān)聯(lián)

最后作者用spearman相關(guān)性分析了腫瘤組織中的差異菌屬和代謝物之間的關(guān)聯(lián)（圖10）。發(fā)現(xiàn)，Acidobacteriaceae在對照組小鼠的腫瘤組織中富集，它們與非壞死腫瘤組織中糖酵解代謝途徑中的差異代謝物（乳酸）表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)。對照組小鼠腫瘤組織中的Acidobacteriales或Acidobacteriaceae與非壞死腫瘤組織中Gln（谷氨酸、琥珀酸和蘋果酸）和腺苷代謝（AMP、ADP、UMP、GMP和尿酸）途徑的不同代謝物表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)，Akk灌胃的肺癌小鼠的腫瘤組織中富含的Bacteroides、Dubosiella和Methylovirgula則表現(xiàn)出明顯的負相關(guān)。結(jié)果表明，這些Akk共生細菌很可能在Gln和腺苷代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

圖10 | 差異菌群與差異代謝物的關(guān)聯(lián)分析

研究結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，腸道Akk可能通過血液循環(huán)遷移和定植到肺癌組織，并隨后影響肺癌的共生微生物組。重要的是，腸道Akk與腫瘤微生物組的互作可能通過代謝重編程形成有利的抗癌微環(huán)境，因此，腫瘤微生物組可能作為癌癥結(jié)果的預(yù)測因素。此外，空間分辨率的代謝組學(xué)分析可以作為一種新的方法來探索腸道微生物組通過調(diào)節(jié)腫瘤代謝的抗癌作用，并在分子水平上（從代謝物到酶）獲得對腸道微生物組調(diào)節(jié)的癌癥代謝重編程的新認識。

 

小鹿推薦

本文主要運用16 s微生物組以及AFADESI空間代謝組技術(shù)，探究了Akk灌胃后對瘤內(nèi)菌群的影響，以及對腫瘤代謝的影響，進而探究了Akk影響腫瘤的可能機制。AFADESI空間代謝組可以檢測到有機酸、氨基酸、嘧啶及嘌呤等物質(zhì)，并對其進行原位成像。此外，通過空間聚類分析可以清晰展示區(qū)域特異性，有力地解決了通過手術(shù)方式或激光切割精確分割癌區(qū)的難題。

關(guān)注鹿明生物提供優(yōu)質(zhì)的空間代謝組服務(wù)

空代儀器平臺

已搭建2套AFADESI-MSI質(zhì)譜成像系統(tǒng)；
 

項目執(zhí)行

已落地執(zhí)行項目百余項、檢測組織樣本類型20+；
 

定性算法經(jīng)過多維校準

定性結(jié)果同時考慮物質(zhì)表達空間情況、加和離子及同位素峰表達強度相似性、同位素表達空間分布相似性、非靶向質(zhì)譜數(shù)據(jù)和空代自建數(shù)據(jù)庫進行校準。

項目實測結(jié)果

可實現(xiàn)定性代謝物數(shù)量：1000-3000個代謝物；

無偏好性檢測代謝物：70%為700Da以下的小分子物質(zhì)，30%為脂質(zhì)類物質(zhì)，更加適合代謝組學(xué)研究方向。