結(jié)膜疾病是一種嚴(yán)重影響患者視力的眼表疾病。利用結(jié)膜干細(xì)胞（CjSC）進(jìn)行干細(xì)胞治療已成為治療結(jié)膜疾病的一種很有前途的方法。然而，關(guān)于CjSC的培養(yǎng)和微創(chuàng)CjSC移植的研究仍然不足。在這里，利用CELLINK的BIONOVA X 3D生物打印機(jī)開發(fā)了一種負(fù)載CjSC水凝膠微結(jié)構(gòu) (Hydrogel micro-constructs)。生物打印的水凝膠微構(gòu)建體可以支持CjSC的活力、干細(xì)胞表型和對結(jié)膜杯狀細(xì)胞的不同分化效力。這些具有可調(diào)力學(xué)剛性的細(xì)胞水凝膠微結(jié)構(gòu)可用于CjSC的擴(kuò)增動態(tài)懸浮培養(yǎng)，或作為一種載體，通過微創(chuàng)結(jié)膜下注射將CjSC輸送至球結(jié)膜上皮，作為干細(xì)胞治療眼病的方法。
關(guān)注重點(diǎn)：
1. 3D生物打印的負(fù)載細(xì)胞微水凝膠載體能支持高細(xì)胞活力。
2. 水凝膠載體的力學(xué)剛度對細(xì)胞活力的直接影響與條件優(yōu)化。
3. 能維持CjSC的表型和分化潛能。
4. 動態(tài)懸浮培養(yǎng)對細(xì)胞活力以及細(xì)胞增殖和分化潛能的影響。
5. 負(fù)載細(xì)胞微水凝膠載體的離體結(jié)膜下注射 。
       
CELLINK的BIONOVA X 是基于DLP（Digital Light Procession）的3D生物打印專利技術(shù), 能提供一種制造3D構(gòu)建體的工作流程，該構(gòu)建體保持高細(xì)胞活力，并滿足許多關(guān)鍵要求，可轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞療法（Fig 1）。BIONOVA X可以在極短的時(shí)間內(nèi)以高分辨率和高通量輕松打印定制的3D幾何圖形（一個(gè)結(jié)構(gòu)的時(shí)間 30秒）。這樣的過程降低了細(xì)胞污染和不必要的暴露的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。此外，懸浮在水凝膠中的細(xì)胞，  BIONOVA X 它允許調(diào)整水凝膠力學(xué)剛度，這直接影響細(xì)胞的活力。另外還能確保細(xì)胞保持封裝和固定，最大限度地提高它們對植入的影響。
        這種高通量解決方案可以快速產(chǎn)生多種不同結(jié)構(gòu)與剛性的含細(xì)胞微水凝膠載體（直徑100μm，高度100μm）。這種高通量制造，再加上高細(xì)胞活力驗(yàn)證篩選，證明了使用BIONOVA X作為細(xì)胞治療開發(fā)的可擴(kuò)展制造方法的巨大潛力。          
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的力學(xué)特征在細(xì)胞分化和增殖過程中起著關(guān)鍵作用。然而，ECM力學(xué)特征對CjSC行為的影響仍不清楚。研究支架剛度和曝光時(shí)間之間的關(guān)系，以確定封裝CjSC的最佳打印條件。應(yīng)用四個(gè)暴露時(shí)間（即15秒、20秒、25秒和30秒）來制造支架�？紤]到通常與CjSC相關(guān)的體內(nèi)環(huán)境，確定通過20秒的暴露時(shí)間可以有利地滿足較軟的硬度。這種較短的曝光時(shí)間也確保了減少細(xì)胞對光的任何不必要的曝光 (Fig 2)。        
為了用CjSC建立有效的細(xì)胞療法，維持干細(xì)胞特性至關(guān)重要。在這里，我們在CjSC包封的微水凝膠載體上進(jìn)行了為期6天的培養(yǎng)，研究結(jié)果證實(shí)3D微水凝膠載體支架是可以長時(shí)間維持被包封CjSC的干細(xì)胞表型和分化潛能 (Fig 3)。        
要開發(fā)一種可臨床轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品，可擴(kuò)大制造是一個(gè)必不可少的要素。動態(tài)懸浮培養(yǎng)被認(rèn)為有利于提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、降低成本和提高產(chǎn)量。為了探索細(xì)胞增殖的可擴(kuò)展性和負(fù)載細(xì)胞的微水凝膠載體作為臨床應(yīng)用的細(xì)胞遞送系統(tǒng)的潛力，對含CjSC微水凝膠進(jìn)行了動態(tài)懸浮培養(yǎng)。其結(jié)果證明BIONOVA X打印的3D微水凝膠載體中， 與靜態(tài)條件下培養(yǎng)比較，動態(tài)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞活力更強(qiáng)。同時(shí)有效地保持了包埋在微水凝膠中的細(xì)胞的增殖和分化能力(Fig 4)。證明了這種擴(kuò)大生物制造的途徑，以及增加了制造這種基于細(xì)胞的療法的可行性。        
微水凝膠載體本身的粘度具有剪切稀化特性。剪切變薄特性對注射過程至關(guān)重要，因?yàn)樗�在注射過程中保護(hù)包封的細(xì)胞免受剪切力的影響，并確保水凝膠載體在移植后保持其保真度并支持其固定。通過臨床使用的30號針頭（內(nèi)徑~159μm）將載有細(xì)胞的水凝膠注射到離體兔眼的球結(jié)膜上皮中。驗(yàn)證3D生物打印的載有細(xì)胞的微水凝膠構(gòu)建體可以作為通過微創(chuàng)注射將CjSC遞送到靶向結(jié)膜下區(qū)域的良好載體。除了治療眼表疾病外，這種可臨床轉(zhuǎn)化模型還可以進(jìn)一步擴(kuò)展到其他體內(nèi)細(xì)胞治療應(yīng)用。