2023年03月，南通大學團隊在Cell Death Discovery期刊上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing reveals cell landscape following antimony exposure during spermatogenesis in Drosophila testes”的研究成果，該論文第一署名單位為南通大學，于駿為第一作者，趙新元、孫斐、顧志峰為共通訊作者。該研究通過構(gòu)建銻(Antimony, Sb)暴露下果蠅模型和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)分析，揭示了銻暴露后果蠅睪丸各細胞簇的轉(zhuǎn)錄特征變化，并揭示了一些重要的信號通路/基因家族與銻暴露介導(dǎo)的睪丸生殖毒性相關(guān)。擬時序分析揭示了生殖細胞分化過程中的三個階段，并發(fā)現(xiàn)階段依賴性關(guān)鍵基因(如Dup98B)可能參與調(diào)控了銻暴露介導(dǎo)的果蠅睪丸生精過程障礙，在單細胞分辨率上闡明了銻暴露對果蠅睪丸生殖毒性的影響。
新格元在該研究中承擔了組織解離、文庫構(gòu)建及單細胞轉(zhuǎn)錄組(GEXSCOPE®)測序等工作。
 
研究背景
銻(Antimony, Sb)是一種帶有銀色光澤的灰色金屬，在自然界主要以硫化物礦物輝銻礦的形式存在。隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，銻礦的過度開采和冶煉導(dǎo)致大量的銻元素被釋放出來，銻元素不但會污染自然環(huán)境，還對人體有害。當人體內(nèi)銻含量超標時，會損傷人體組織，嚴重時會毒害心臟、肝臟和生殖系統(tǒng)。相對于其它金屬污染物，銻的毒性效應(yīng)遠未闡明。

據(jù)報道，近15%育齡夫婦被不育癥所困擾，其中男性不育癥的發(fā)病原因較多且復(fù)雜，已知的明確病因包括精索靜脈曲張、感染等，但仍有30%患者的病因不明確，可能與環(huán)境污染因素密切相關(guān)。近幾十年來，環(huán)境污染因素的種類和數(shù)量迅速增加，環(huán)境因素對精液質(zhì)量的負面影響越來越受到人們的重視。目前，銻暴露和男性精子質(zhì)量下降及男性生殖功能障礙是否有關(guān)仍有較大爭議。因此，本研究采用以銻暴露后雄性果蠅睪丸為研究模型，探究了銻暴露對果蠅睪丸精子發(fā)生的影響及在單細胞分辨率下揭示相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
 
方法流程  
研究結(jié)果
1.銻暴露介導(dǎo)果蠅睪丸生殖毒性效應(yīng)
為了研究銻暴露在果蠅睪丸中的毒理學效應(yīng)，作者檢測了在0、0.3、0.6和1.2mg/mL的銻暴露下果蠅睪丸中生殖干細胞(GSCs)和長形精子細胞簇的數(shù)量。結(jié)果表明，與對照組(0mg/mL)睪丸相比，不同濃度(0.3、0.6或1.2mg/mL)的銻暴露10天后以劑量依賴的方式顯著減少了GSCs的數(shù)量(圖1A,B)。此外，作者進一步統(tǒng)計了長形精子細胞簇的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)了其顯著的以劑量依賴性減少(圖1C,D)，提示銻暴露參與了果蠅睪丸的分化和損傷長形精子的形成。以上結(jié)果表明，銻暴露會導(dǎo)致果蠅睪丸精子發(fā)生過程中的生殖毒性。
2.果蠅睪丸的單細胞圖譜
為了探究果蠅睪丸中受銻暴露影響的細胞類型，作者對銻暴露和正常組(每組180只雄性果蠅)新鮮睪丸組織進行了scRNA-seq分析(圖2A)。經(jīng)過質(zhì)控后共捕獲到9180個高質(zhì)量細胞用于后續(xù)分析，每個細胞的中值UMI和中值基因數(shù)分別是10821.5和2058。根據(jù)已發(fā)表的標記基因，共注釋為12個細胞群，幾乎涵蓋了果蠅睪丸的所有細胞類型(圖2)。
3.銻暴露后果蠅睪丸細胞群變化特征
為了進一步探索銻暴露對果蠅睪丸細胞群的影響，作者對對照組和銻暴露組細胞群分布進行分析，結(jié)果表明銻暴露后，各細胞類型的占比顯著降低，這些變化在生殖細胞中最為明顯(圖3A-C)，提示了銻暴露在精子發(fā)生過程中的生殖毒性。由于在GSCs和精子細胞中鑒定出銻暴露對精子發(fā)生的表型，因此接下來的分析主要集中在GSCs_to_Early_Spermatogonia和Spermatids簇。在這兩個細胞群中，生殖細胞中的DEGs顯著增加，分別為925個(上調(diào)177個，下調(diào)748個)和605個(上調(diào)352個，下調(diào)253個) (圖3E)。以上結(jié)果表明，銻暴露后果蠅睪丸細胞群具有明顯的特征變化。 接下來作者探討了銻暴露對生殖細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，對GSCs_to_Early_Spermatogonia細胞簇進行差異基因的富集分析。GO富集結(jié)果多與精子發(fā)生有關(guān)(圖4A)，而KEGG富集結(jié)果表明，包括碳代謝在內(nèi)的多種代謝通路揭示了在GSCs/早期精原細胞維持中銻暴露與遺傳的相互作用(圖4B)。同時，作者也注意到，在果蠅睪丸中，SCP-Containing Proteins、S-LAPs和Mst84D基因家族在銻暴露后的表達趨勢表現(xiàn)出高度一致性，并研究了這些特征與相應(yīng)睪丸細胞群中碳代謝途徑的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)碳代謝與SCP-Containing Proteins、S-LAPs和Mst84D特征呈正相關(guān)性(圖4C)。接下來，作者進一步檢測了果蠅睪丸相關(guān)特征中關(guān)鍵因子[碳代謝相關(guān)因子(CG7059、CG32026和CG9314)、SCP-Containing Proteins (scpr-A、scpr-B、scpr-C)、S-LAPs (S-Lap1、S-Lap3)及Mst84D (Mst84Dc)]的相對mRNA水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，銻暴露組睪丸顯著降低(圖4E-G)。除此之外，作者利用免疫熒光和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法鑒定了在精子細胞發(fā)育過程中銻暴露后果蠅睪丸中的三個主要特征的變化，進一步驗證了單細胞數(shù)據(jù)的結(jié)果。綜上所述，這些結(jié)果有助于揭示銻暴露-遺傳交互作用在早期生殖細胞維持過程中的調(diào)控機制。
5.銻暴露介導(dǎo)精子發(fā)生的三個階段
為進一步探究銻暴露后果蠅睪丸中的生殖細胞特征，作者對精子發(fā)生過程中的生殖細胞進行了擬時序分析(圖5A)，并在果蠅睪丸中確定了三種階段(圖5B)。值得注意的是，在銻暴露后，各階段下的生殖細胞數(shù)量和占比都顯著降低(圖5D,E)。重要的是，階段1的生殖細胞主要由GSCs/早期精原細胞組成，而階段2和階段3的生殖細胞則趨向于由減數(shù)分裂期的精母細胞和減數(shù)分裂后的精子細胞聚集(圖5F)。為了區(qū)分擬時軌跡分析中出現(xiàn)的兩個分支，將階段1/階段2定義為分支1，階段1/階段3定義為分支2，根據(jù)其表達模式，作者鑒定到一系列代表性基因可以進一步區(qū)分這兩個分支狀態(tài)(在分支2中高表達，且在分支1中低表達)(圖5G)。進一步分析銻暴露后果蠅睪丸中三種狀態(tài)的特征，發(fā)現(xiàn)了三種主要的表達模式：階段1特異性表達SmB和Fkbp39等基因，階段2和階段3表達CG43371、CG12861等基因，且whip、CG12126等基因在階段3中高度富集(圖6)。這些基因的表達模式研究有助于深入理解銻暴露介導(dǎo)的生精細胞異常調(diào)控機制。 結(jié)論
銻暴露引起睪丸毒性的觀點仍存爭議。本研究通過建立雄性果蠅睪丸銻暴露模型，探討銻暴露對果蠅睪丸精子發(fā)生的影響及在單細胞分辨率下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。本研究為科研人員認識銻暴露的生殖毒性提供了依據(jù)，證明銻暴露對果蠅睪丸的GSC維持和長形精子延伸有毒害作用，影響了果蠅精子發(fā)生的關(guān)鍵步驟。本研究在單細胞分辨率上闡明了銻暴露介導(dǎo)果蠅睪丸毒性的分子基礎(chǔ)和調(diào)控信號的研究，為環(huán)境化學物質(zhì)引起生殖毒性損傷的調(diào)控機制提供了新的視角。
 
 
參考文獻
Yu J, Fu Y, Li Z, et al. Single-cell RNA sequencing reveals cell landscape following antimony exposure during spermatogenesis in Drosophila testes. Cell Death Discov. 2023 Mar 9;9(1):86. doi: 10.1038/s41420-023-01391-4.