間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）近年來(lái)被廣泛應(yīng)用在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可促進(jìn)各種結(jié)締組織的再生。大量證據(jù)表明，移植的MSC通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外囊泡來(lái)廣泛促進(jìn)組織再生。與單個(gè)分散細(xì)胞相比，MSC在聚集成球狀體后可分泌更高濃度的因子，從而進(jìn)一步提高了組織的再生潛能。

然而，盡管MSC球狀體擁有良好的治療前景，但它們?cè)隗w內(nèi)的存活率卻很低，且由于降解和擴(kuò)散，這些生物活性因子只能短暫存在于特定的傷口部位。為了解決這個(gè)問題，加州大學(xué)戴維斯分校（UC Davis）的研究人員合成了一種硫酸化海藻酸鹽水凝膠平臺(tái)，希望通過(guò)封住MSC球狀體分泌的因子來(lái)增強(qiáng)組織再生。

該研究發(fā)現(xiàn)，MSC球狀體與硫酸化海藻酸鹽的結(jié)合使用可促進(jìn)肌肉再生。這項(xiàng)研究成果于2023年1月1日發(fā)表在《Acta Biomaterialia》雜志上，有望應(yīng)用于肌肉損傷的修復(fù)。
 

研究材料與方法

在這項(xiàng)研究中，SD大鼠骨髓來(lái)源的MSC購(gòu)自賽業(yè)OriCell^®，研究人員在細(xì)胞傳代后將其培養(yǎng)成MSC球狀體，并轉(zhuǎn)移到海藻酸鹽溶液中，交聯(lián)形成水凝膠。他們?cè)谘芯恐惺褂昧薙D大鼠的比目魚肌擠壓傷模型。他們使用偏振光顯微鏡分析了膠原蛋白質(zhì)量和組成，并采用羥脯氨酸含量分析來(lái)測(cè)定膠原蛋白溶解度。

技術(shù)路線

1.構(gòu)建包含MSC球狀體的硫酸化海藻酸鹽水凝膠

2.評(píng)估硫酸化MSC球狀體是否會(huì)誘導(dǎo)膠原蛋白沉積

3.評(píng)估這種新型水凝膠處理對(duì)神經(jīng)支配和血管形成的影響

4.評(píng)估肌源性分化標(biāo)志物的表達(dá)，以確定再生肌纖維的成熟度

研究結(jié)果

研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MSC球狀體被包裹在硫酸化海藻酸鹽水凝膠中時(shí)，生物活性生長(zhǎng)因子的保留時(shí)間延長(zhǎng)，有助于血管內(nèi)皮形成和成肌細(xì)胞侵襲。于是，他們將這種水凝膠（sulfated）植入大鼠比目魚肌擠壓傷模型中，以評(píng)估其治療潛力。對(duì)照組包括非硫酸化的水凝膠（non-sulfated）和無(wú)細(xì)胞的硫酸化水凝膠（sulfated acellular）。

植入后六周，近紅外成像結(jié)果顯示，硫酸化和非硫酸化水凝膠中的MSC水平相似（圖1），說(shuō)明硫酸化不影響球狀體的生存能力。與對(duì)照組相比，包含MSC球狀體的組表現(xiàn)出更厚且更深色的肌肉。組織H&E成像結(jié)果顯示，水凝膠植入兩周后各個(gè)組中會(huì)出現(xiàn)纖維化組織。與非硫酸化組相比，硫酸化組的纖維化組織在六周時(shí)有所減少，表明硫酸化處理導(dǎo)致更有組織的肌肉再生。
 

硫酸化不影響MSC的生存能力^[1]

在肌肉再生過(guò)程中，一種常見的失調(diào)是形成纖維化的瘢痕組織，其主要由膠原蛋白組成，會(huì)嚴(yán)重限制肌肉的活動(dòng)能力。于是，研究人員對(duì)上述肌肉組織中的總體膠原蛋白水平和不溶性膠原蛋白比例進(jìn)行了量化，以便確認(rèn)纖維化反應(yīng)。結(jié)果顯示，與其他組相比，硫酸化MSC球狀體處理引起的過(guò)剩膠原蛋白較少，說(shuō)明它并沒有誘發(fā)嚴(yán)重的纖維化反應(yīng)。在進(jìn)一步分析膠原蛋白的組成后，研究人員確認(rèn)硫酸化球狀體組誘導(dǎo)的膠原蛋白沉積量較低，膠原蛋白壓實(shí)程度與未受傷的肌肉更相似。

02 包含球狀體的硫酸化水凝膠對(duì)肌肉再生的影響
之后，研究人員評(píng)估了水凝膠處理對(duì)神經(jīng)支配和血管形成的影響。在水凝膠植入六周后，通過(guò)對(duì)乙酰膽堿受體進(jìn)行染色，經(jīng)硫酸化球狀體處理的損傷顯示出更多的神經(jīng)肌肉接頭。再通過(guò)對(duì)血管標(biāo)志物CD31的免疫組化染色，他們發(fā)現(xiàn)隨著球狀體的加入，陽(yáng)性染色呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)（圖2）。這些數(shù)據(jù)表明，硫酸化球狀體組顯著改善了神經(jīng)肌肉接頭的生成，促進(jìn)了新血管的形成，并在兩周后產(chǎn)生了更多成熟的肌纖維，表明這是一個(gè)有利于神經(jīng)支配和血管形成的環(huán)境。

圖2. 包含球狀體的硫酸化水凝膠促進(jìn)了血管形成和神經(jīng)支配^[1]

研究人員還發(fā)現(xiàn)，六周后再生的肌肉在物理和機(jī)械特性上都與對(duì)側(cè)對(duì)照肌肉相當(dāng)。硫酸化水凝膠的加入引起肌肉彈性增加，在20%應(yīng)變下的被動(dòng)動(dòng)態(tài)應(yīng)力明顯下降。運(yùn)動(dòng)范圍分析顯示，六周時(shí)的運(yùn)動(dòng)范圍與對(duì)側(cè)對(duì)照組相似。這些數(shù)據(jù)表明，在植入水凝膠六周后，損傷組織在被動(dòng)物理特征方面都接近完全再生。

為了進(jìn)一步分析再生肌纖維的成熟度，研究人員還通過(guò)RT-PCR測(cè)定了常見的肌源性分化標(biāo)志物的表達(dá)。在損傷后兩周，硫酸化水凝膠中MSC球狀體的處理導(dǎo)致肌肉分化標(biāo)志物Myog的表達(dá)增加。不過(guò)在六周時(shí)，各組之間的成熟肌肉形成標(biāo)志物Myh2表達(dá)相似。他們認(rèn)為，硫酸化水凝膠的處理加速了肌纖維的成熟，但由于自然修復(fù)機(jī)制的作用，若評(píng)估的時(shí)間點(diǎn)較晚，其效果就會(huì)減弱。
 

結(jié)論

研究示意圖^[1]

這項(xiàng)研究采用一系列分析技術(shù)評(píng)估了硫酸化海藻酸鹽材料修復(fù)大鼠比目魚肌擠壓傷的能力（圖3）。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化海藻酸鹽與MSC球狀體的組合減少了膠原蛋白沉積，改善了肌源性分化標(biāo)志物表達(dá)，并增加了神經(jīng)肌肉接頭，表明這種方法有望促進(jìn)肌肉再生并減少纖維化。

原文檢索
[1]M.A. Gionet-Gonzales, R.C.H. Gresham, K.H. Griffin et al., Mesenchymal stromal cell spheroids in sulfated alginate enhance muscle regeneration, Acta Biomaterialia, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.10.054