納米級分辨率顯微鏡Nanoimager在結(jié)締組織疾病中的應(yīng)用
賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員在研究結(jié)締組織內(nèi)因肌腱炎而惡化的細胞時發(fā)現(xiàn)，當細胞所處的微環(huán)境發(fā)生病變時，會導(dǎo)致染色質(zhì)產(chǎn)生空間和密度的不可逆變化，使其無法正常編碼遺傳信息。這項研究結(jié)果于2022年8月22日發(fā)表在Nature Biomedical Engineering上，指出了新療法（例如小分子療法）的可能性。
染色質(zhì)空間組織變化大多發(fā)生在納米尺度上（10-100nm），使用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡來研究這一現(xiàn)象一直具有挑戰(zhàn)性。雖然基于高通量染色體構(gòu)象捕獲的方法能夠提供關(guān)于基因組組織有價值的信息，但這種方法通常需要大量的細胞，掩蓋了細胞間的異質(zhì)性。
在此研究中，作者使用Nanoimager單分子成像與功能分析系統(tǒng)，獲得了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的納米級高分辨率圖像，確定了結(jié)締組織的微觀化學(xué)物理環(huán)境在納米尺度上如何調(diào)節(jié)染色質(zhì)的組織變化，為治療結(jié)締組織疾病提供了新的治療策略。
研 究 結(jié) 果
1. 組織惡化改變hTCs的染色質(zhì)組織
已知組織惡化或衰老會改變致密結(jié)締組織的力學(xué)環(huán)境，因此作者使用超分辨率成像和定量分析來確定衰老和組織惡化是否會導(dǎo)致基因組組織的改變。
從三種不同供體（1.健康的年輕人、2.已確診肌腱病的年輕人、3.健康的老年人）的人體肌腱中分離出肌腱細胞（hTCs），超分辨率圖像顯示，健康年輕人的hTCs細胞核中，染色質(zhì)分布在整個細胞核中。然而，組蛋白H2B 出人意料地主要定位于已確診肌腱病的年輕人hTCs細胞核的核外周。為進一步量化不同細胞類型中的染色質(zhì)組織，使用圖像分割軟件Voronoi進行細分，結(jié)果顯示，與健康hTCs相比，無論核外圍還是核內(nèi)部的染色質(zhì)，病變hTCs的稀疏和致密染色質(zhì)間室都更加緊湊。這些數(shù)據(jù)表明，組織惡化和衰老都影響hTCs中染色質(zhì)組織的空間不同模式。
圖1.（a）5um和300nm標尺下的H2B 的STORM圖像。（b）單位面積內(nèi)組蛋白H2B在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的定位數(shù)量比例。（c）是（a）中的組蛋白H2B經(jīng)Voronoi渲染后的數(shù)據(jù)，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（d）年輕、肌腱病和老年供體hTCs致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。
2. 基質(zhì)剛度改變hMSCs中的染色質(zhì)組織
組織(包括肌腱組織)具有很大的剛度范圍，組織變性能改變細胞外基質(zhì)（ECM）的化學(xué)物理環(huán)境。因此，作者假設(shè)，病變hTCs(或其祖細胞)基因組組織的變化可能是由惡化的組織微環(huán)境中的異�；瘜W(xué)-力學(xué)信號驅(qū)動的，特別是由組織剛度的變化引起的。
為了評估生理和病理相關(guān)的生物物理信號如何在納米尺度上影響基因組組織，作者選擇了人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）這種可以根據(jù)基質(zhì)剛度來適應(yīng)表型的細胞，用這些在不同基質(zhì)上培養(yǎng)的模型細胞來優(yōu)化染色質(zhì)的定量超分辨率成像，并記錄不同的基因組組織的變化。數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)剛度在納米尺度上調(diào)控了hMSCs的染色質(zhì)在空間上的組織和凝縮。
圖2.（a）培養(yǎng)在三種不同基質(zhì)上的hMSCs內(nèi)組蛋白H2B的STORM圖像。在Stiff和Glass兩組里，H2B在核內(nèi)分布更為均一，而在Soft組里，H2B則更多分布于核外圍。（b）單位面積內(nèi)組蛋白H2B在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的定位數(shù)量比例。（c）是（a）中的組蛋白H2B經(jīng)Voronoi渲染后的數(shù)據(jù)，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（d）三種不同基質(zhì)上hMSCs細胞核致密染色質(zhì)室染色質(zhì)凝縮的變化
3. 基質(zhì)剛度改變hMSCs的組蛋白甲基化水平
接著，作者研究了基質(zhì)剛度是否也會導(dǎo)致活性染色質(zhì)（標記物為H3K4me3）和異染色質(zhì)（標記物為H3K27me3）的定位和凝縮狀態(tài)的變化。
作者用兩種特定組蛋白修飾的抗體對hMSCs進行標記，并獲得了三種基質(zhì)條件下的超分辨率圖像。H3K4me3的熱圖和定量分析表明，與玻璃基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs相比，在硬基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs中H3K4me3的水平略有升高，而在軟基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs中，H3K4me3的水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)與前面描述的H2B凝縮分析一致，表明活性組蛋白標記的丟失與軟基質(zhì)上染色質(zhì)凝縮的增加相關(guān)。相反，與玻璃基質(zhì)相比，H3K27me3在硬基質(zhì)上的含量較低(特別是在核內(nèi)部)，而在軟基質(zhì)上的含量較高(特別是在核外圍)。這些結(jié)果表明，外周染色質(zhì)定位的增加和軟基質(zhì)上染色質(zhì)凝縮的增加與H3K27me3水平的增加進一步相關(guān)，這表明軟基質(zhì)可能導(dǎo)致基因抑制。
在觀察到基質(zhì)剛度在納米尺度上調(diào)控染色質(zhì)的組織，以及基質(zhì)依賴性染色質(zhì)重構(gòu)與組蛋白甲基化標記水平的變化相關(guān)后，作者進一步研究了zeste同源物2 (EZH2，催化H3K27me3)的甲基轉(zhuǎn)移酶增強子的作用，數(shù)據(jù)表明基質(zhì)剛度通過改變hMSCs中的細胞收縮力和組蛋白甲基化狀態(tài)來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的空間組織和凝縮。
圖3.（a）和（c）分別是H3K4me3和H3K27me3的STORM圖像。（b）和（d）是在不同的基質(zhì)上培養(yǎng)的hMSCs中，在單位面積內(nèi)在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)H3K4me3和H3K27me3的定位數(shù)量比例。（e）是三種不同基質(zhì)上培養(yǎng)的經(jīng)GSK和不經(jīng)GSK處理的hMSCs細胞核中組蛋白H2B數(shù)據(jù)，經(jīng)Voronoi渲染后，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（f）使用和不使用GSK處理時，核邊界和核內(nèi)區(qū)域之間H2B定位的變化被量化為核邊界單位面積上H2B定位的數(shù)量與核內(nèi)區(qū)域單位面積上H2B定位的總數(shù)之比。（g）與對照組hMSCs相比，GSK處理的hMSCs中致密染色質(zhì)凝縮水平的變化。
4. 染色質(zhì)重構(gòu)的預(yù)測
異染色質(zhì)的形成以前被認為是多種機制的結(jié)果，包括染色質(zhì)和染色質(zhì)相關(guān)蛋白（如HP1α）的液-液相分離、連接蛋白組蛋白H1中和靜電電荷和轉(zhuǎn)錄沉默。如前所述，已知特定的表觀遺傳標記與濃縮異染色質(zhì)或開放性常染色質(zhì)相關(guān)。然而，表觀遺傳調(diào)控因子對染色質(zhì)組織的影響尚未完全了解，乙酰化和甲基化的動力學(xué)是否能改變?nèi)旧|(zhì)的凝縮尚不清楚。為了探索這些，并確定觀察到的基質(zhì)剛度對染色質(zhì)凝縮的影響是否是組蛋白甲基化狀態(tài)變化的結(jié)果，作者開發(fā)了一個模擬異染色質(zhì)形成的相場模型。這個模型概括了組蛋白甲基化水平的基質(zhì)依賴性變化如何影響細胞核染色質(zhì)的空間組織的實驗結(jié)果，為乙�；图谆脚c相分離競爭并影響染色質(zhì)組織提供了數(shù)據(jù)支持。
圖4.（a）甲基化的增加對染色質(zhì)組織的影響，藍色和紅色分別代表常染色質(zhì)和異染色質(zhì)富集的區(qū)域。（b）異染色質(zhì)簇的大小與甲基化水平的比例關(guān)系。（c）核邊界異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域（BHDs）厚度與甲基化水平的比例關(guān)系。（d）在軟或硬基質(zhì)上培養(yǎng)的細胞，實驗測量和模型預(yù)測的核邊界和核內(nèi)部異染色質(zhì)百分比。左邊圖像對應(yīng)的是前圖中按照Voronoi多邊形大小編碼的H2B顏色的STORM圖像。右邊的圖像與模型預(yù)測相對應(yīng)，藍色為常染色質(zhì)，紅色為異染色質(zhì)。（e）在軟基質(zhì)上培養(yǎng)的經(jīng)GSK343處理或不經(jīng)GSK343處理的細胞，實驗測量和模型預(yù)測的核邊界和核內(nèi)部異染色質(zhì)百分比。左邊圖像對應(yīng)的是前圖中按照Voronoi多邊形大小編碼的H2B顏色的實驗STORM圖像。右邊的圖像與模型預(yù)測相對應(yīng)，藍色為常染色質(zhì)，紅色為異染色質(zhì)。
5. 染色質(zhì)在動態(tài)力學(xué)信號下快速重組
現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)剛度通過影響細胞相容性和下游甲基轉(zhuǎn)移酶活性來改變?nèi)旧|(zhì)的組織和定位，但這種靜態(tài)時不變的力學(xué)信號不能復(fù)制主動負載細胞環(huán)境中重構(gòu)的動態(tài)和時變特征。因此，作者接下來研究了生物物理環(huán)境的動態(tài)變化如何影響hMSC的細胞核在納米尺度上的染色質(zhì)組織。作者使用原位基質(zhì)增強系統(tǒng)來評估人骨髓間充質(zhì)干細胞中H2B納米空間組織和染色質(zhì)凝縮的變化。細胞在“硬化水凝膠”系統(tǒng)上培養(yǎng)，該系統(tǒng)提供了基質(zhì)剛度從軟（約3kPa）到硬（約30kPa）的力學(xué)狀態(tài)的快速變化。H2B密度的熱圖顯示，硬化后的最初6小時，染色質(zhì)主要定位于核周邊，硬化后6～48h，染色質(zhì)從核周邊向核內(nèi)部不斷重新分布。染色質(zhì)空間組織的這些變化伴隨著稀疏和致密染色質(zhì)室的凝縮狀態(tài)的持續(xù)下降。
有趣的是，硬化后2h開始凝縮變化，因此在空間組織變化之前，這表明染色質(zhì)的解聚可能導(dǎo)致其在細胞核中的空間重構(gòu)。硬化后18小時，解凝縮量達到起始值的60%左右，并持續(xù)至第7天。作者接下來研究了肌動球蛋白驅(qū)動的收縮力在染色質(zhì)組織和響應(yīng)基質(zhì)硬化的縮合中的作用。數(shù)據(jù)表明，ECM-硬化介導(dǎo)的染色質(zhì)解致密化和從hMSC細胞核邊界到內(nèi)部的再分布需要肌動球蛋白為基礎(chǔ)的細胞收縮。總之，這些數(shù)據(jù)表明，動態(tài)生物物理擾動以復(fù)雜而快速的方式調(diào)節(jié)hMSCs細胞核中的納米尺度的染色質(zhì)組織。
圖5.（a）硬化后0-48h，組蛋白H2B從核外圍到核內(nèi)部連續(xù)重分布的STORM圖像。（b）核邊界H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比值。（c）硬化后0-48h，hMSCs內(nèi)致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。（d）在加/不加Y27處理硬化后不同時間的水凝膠上培養(yǎng)的hMSCs，單位面積核邊界H2B定位總數(shù)與核內(nèi)部H2B定位總數(shù)之比，表明Y27在硬化后阻止了染色質(zhì)從核邊界到核內(nèi)部的重新定位。（e）在加/不加Y27的硬化水凝膠上培養(yǎng)的hMSCs中致密染色質(zhì)室染色質(zhì)凝縮的變化，Y27處理可防止硬化后致密染色質(zhì)凝縮隨時間的減少。（f）示意圖顯示ECM硬化如何通過肌動球蛋白為基礎(chǔ)的細胞收縮來調(diào)節(jié)hMSCs中的染色質(zhì)分布和凝縮。ECM硬化使染色質(zhì)從邊界重新分布到hMSC核的內(nèi)部區(qū)域，導(dǎo)致染色質(zhì)去凝，這需要細胞的收縮。
6. “惡化”信號改變hTCs的染色質(zhì)組織
鑒于生物物理信號對體外納米尺度上染色質(zhì)組織的影響的結(jié)果，作者接下來提出了初步假設(shè)：化學(xué)物理環(huán)境（例如軟ECM、缺氧和炎癥）的惡化信號可能引起納米尺度上染色質(zhì)重構(gòu)，并導(dǎo)致年輕健康的hTCs呈現(xiàn)與老年或惡化的（肌腱�。﹉TCs相似的特征。為了驗證這一假設(shè)，作者首先在玻璃、硬（30kPa）或軟（3kPa）基質(zhì)上在基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)從年輕健康供體分離的hTCs 2天。超分辨圖像再次顯示了H2B定位，在玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的年輕健康hTCs的細胞核中形成明顯的H2B納米結(jié)構(gòu)域。有趣的是，年輕hTCs在硬基質(zhì)上培養(yǎng)時，整個細胞核中稀疏和濃縮的染色質(zhì)室的染色質(zhì)凝縮減少，達到與在玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的老年hTCs相似的水平。而在軟基底上培養(yǎng)時，染色質(zhì)重新定位到核周邊并變得更加致密，特別是在核內(nèi)部，這與惡化的hTCs相似�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，肌腱老化或微損傷引起的組織力學(xué)性質(zhì)改變可能會導(dǎo)致疾病中染色質(zhì)組織的一些異常變化。
圖6.（a）培養(yǎng)在三種不同基質(zhì)上的hTCs內(nèi)組蛋白H2B的STORM圖像。（b）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比例，顯示在軟基質(zhì)上培養(yǎng)的hTCs中H2B重新定位到核邊界。（c）組蛋白H2B的STORM圖像，展示在常氧條件下年輕的和肌腱病的hTCs中H2B的定位變化，以及在低氧條件下年輕的hTCs中的H2B定位變化。（d）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比值，顯示缺氧條件下年輕hTCs中H2B重新定位到核邊界。（e）組蛋白H2B的STORM圖像，展示的是在有/沒有IL-1β和TNF-α的玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的hTCs中H2B定位的變化。（f）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比例，顯示hTCs在經(jīng)炎癥因子處理后H2B的重新定位到核邊界。
7. 惡化影響hTCs的力學(xué)靈敏度
鑒于hTCs能夠通過改變?nèi)旧|(zhì)的空間組織和凝縮來迅速應(yīng)對力學(xué)環(huán)境的變化，作者最后研究了組織惡化或老化如何影響其力學(xué)敏感性。超分辨成像結(jié)果顯示，年輕、肌腱病和老年hTCs中的H2B在硬化后4小時內(nèi)主要定位于核周邊。硬化24小時后，年輕hTCs中的染色質(zhì)在整個細胞核中變得更均勻地分散和去致密。老化細胞對基質(zhì)剛度的增加也有相同的反應(yīng)趨勢，但在染色質(zhì)解致密化方面程度較低。然而，當肌腱病變細胞在硬化的水凝膠上培養(yǎng)時，染色質(zhì)的空間組織沒有變化，特別是在核周邊染色質(zhì)失活的程度，與年輕和老年細胞相比明顯更低。這些數(shù)據(jù)表明，hTCs染色質(zhì)組織的長期改變可能與惡化引起的力學(xué)靈敏性喪失有關(guān)。
圖7. （a）硬化后4h和24h，不同組的hTCs組蛋白H2B分布的STORM圖像。（b）核邊界單位面積上H2B定位總數(shù)與核內(nèi)區(qū)域H2B定位總數(shù)的比例，顯示在肌腱病組的hTCs在基質(zhì)硬化后H2B重新定位到核內(nèi)部的過程沒有及時反應(yīng)。（c）硬化24 h后致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。
研 究 結(jié) 論
在這項研究中，基于強大的超分辨率顯微鏡Nanoimager，作者在納米尺度上展示了健康纖維組織和祖細胞細胞核中染色質(zhì)組織對力學(xué)性能具有高度的響應(yīng)性，這種響應(yīng)性依賴于獨特的細胞骨架網(wǎng)絡(luò)和組蛋白修飾的動態(tài)變化，這對如何以及何時應(yīng)用臨床療法治療人類疾病具有重要的指導(dǎo)意義。
圖8.基質(zhì)的高硬度改變了以肌動球蛋白為基礎(chǔ)的細胞收縮性，從而促進肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成和局部粘附，并調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾物(例如HDAC和EZH2)進出細胞核。這些表觀遺傳修飾物通過調(diào)節(jié)組蛋白乙�；�/甲基化水平改變?nèi)旧|(zhì)在納米尺度上的空間組織和凝縮。
Nanoimager
Nanoimager作為新一代單分子成像系統(tǒng)的標志性代表，相比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，在技術(shù)的先進性方面具有巨大突破。它克服了光衍射的限制，橫向分辨率可達20nm、軸向分辨率可達50nm，并支持同時雙色成像和順序四色成像，可在空間上對形態(tài)學(xué)和亞細胞動態(tài)進行精確的納米級研究，進一步揭示分子相互作用細節(jié)，使深入探索變得更簡單。
Nanoimager 集成多種高端成像技術(shù)于一體，具備dSTORM（隨機光學(xué)重建顯微技術(shù)）、PALM（光激活定位顯微技術(shù)）、Single Particle Tracking（單分子動態(tài)追蹤與定量）、smFRET（單分子FRET技術(shù)）和Confocal（共聚焦技術(shù)）等技術(shù)模塊，這些優(yōu)勢使它成為信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤和外泌體標志物、病毒增殖和裝配、細胞亞顯微結(jié)構(gòu)表征等研究領(lǐng)域在單分子水平上進行顯微分析的重要幫手。
在此研究中，作者使用Nanoimager單分子成像與功能分析系統(tǒng)，獲得了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的納米級高分辨率圖像，確定了結(jié)締組織的微觀化學(xué)物理環(huán)境在納米尺度上如何調(diào)節(jié)染色質(zhì)的組織變化，為治療結(jié)締組織疾病提供了新的治療策略。
研 究 結(jié) 果
1. 組織惡化改變hTCs的染色質(zhì)組織
已知組織惡化或衰老會改變致密結(jié)締組織的力學(xué)環(huán)境，因此作者使用超分辨率成像和定量分析來確定衰老和組織惡化是否會導(dǎo)致基因組組織的改變。
從三種不同供體（1.健康的年輕人、2.已確診肌腱病的年輕人、3.健康的老年人）的人體肌腱中分離出肌腱細胞（hTCs），超分辨率圖像顯示，健康年輕人的hTCs細胞核中，染色質(zhì)分布在整個細胞核中。然而，組蛋白H2B 出人意料地主要定位于已確診肌腱病的年輕人hTCs細胞核的核外周。為進一步量化不同細胞類型中的染色質(zhì)組織，使用圖像分割軟件Voronoi進行細分，結(jié)果顯示，與健康hTCs相比，無論核外圍還是核內(nèi)部的染色質(zhì)，病變hTCs的稀疏和致密染色質(zhì)間室都更加緊湊。這些數(shù)據(jù)表明，組織惡化和衰老都影響hTCs中染色質(zhì)組織的空間不同模式。
圖1.（a）5um和300nm標尺下的H2B 的STORM圖像。（b）單位面積內(nèi)組蛋白H2B在核邊界和核內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的定位數(shù)量比例。（c）是（a）中的組蛋白H2B經(jīng)Voronoi渲染后的數(shù)據(jù)，紅色是小的Voronoi多邊形，具有較高的組蛋白 H2B密度；藍色是大的Voronoi多邊形，具有較低的組蛋白 H2B密度。（d）年輕、肌腱病和老年供體hTCs致密染色質(zhì)室中染色質(zhì)凝縮的變化。
2. 基質(zhì)剛度改變hMSCs中的染色質(zhì)組織
組織(包括肌腱組織)具有很大的剛度范圍，組織變性能改變細胞外基質(zhì)（ECM）的化學(xué)物理環(huán)境。因此，作者假設(shè)，病變hTCs(或其祖細胞)基因組組織的變化可能是由惡化的組織微環(huán)境中的異�；瘜W(xué)-力學(xué)信號驅(qū)動的，特別是由組織剛度的變化引起的。
為了評估生理和病理相關(guān)的生物物理信號如何在納米尺度上影響基因組組織，作者選擇了人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）這種可以根據(jù)基質(zhì)剛度來適應(yīng)表型的細胞，用這些在不同基質(zhì)上培養(yǎng)的模型細胞來優(yōu)化染色質(zhì)的定量超分辨率成像，并記錄不同的基因組組織的變化。數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)剛度在納米尺度上調(diào)控了hMSCs的染色質(zhì)在空間上的組織和凝縮。
3. 基質(zhì)剛度改變hMSCs的組蛋白甲基化水平
接著，作者研究了基質(zhì)剛度是否也會導(dǎo)致活性染色質(zhì)（標記物為H3K4me3）和異染色質(zhì)（標記物為H3K27me3）的定位和凝縮狀態(tài)的變化。
作者用兩種特定組蛋白修飾的抗體對hMSCs進行標記，并獲得了三種基質(zhì)條件下的超分辨率圖像。H3K4me3的熱圖和定量分析表明，與玻璃基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs相比，在硬基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs中H3K4me3的水平略有升高，而在軟基質(zhì)培養(yǎng)的hMSCs中，H3K4me3的水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)與前面描述的H2B凝縮分析一致，表明活性組蛋白標記的丟失與軟基質(zhì)上染色質(zhì)凝縮的增加相關(guān)。相反，與玻璃基質(zhì)相比，H3K27me3在硬基質(zhì)上的含量較低(特別是在核內(nèi)部)，而在軟基質(zhì)上的含量較高(特別是在核外圍)。這些結(jié)果表明，外周染色質(zhì)定位的增加和軟基質(zhì)上染色質(zhì)凝縮的增加與H3K27me3水平的增加進一步相關(guān)，這表明軟基質(zhì)可能導(dǎo)致基因抑制。
在觀察到基質(zhì)剛度在納米尺度上調(diào)控染色質(zhì)的組織，以及基質(zhì)依賴性染色質(zhì)重構(gòu)與組蛋白甲基化標記水平的變化相關(guān)后，作者進一步研究了zeste同源物2 (EZH2，催化H3K27me3)的甲基轉(zhuǎn)移酶增強子的作用，數(shù)據(jù)表明基質(zhì)剛度通過改變hMSCs中的細胞收縮力和組蛋白甲基化狀態(tài)來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的空間組織和凝縮。
4. 染色質(zhì)重構(gòu)的預(yù)測
異染色質(zhì)的形成以前被認為是多種機制的結(jié)果，包括染色質(zhì)和染色質(zhì)相關(guān)蛋白（如HP1α）的液-液相分離、連接蛋白組蛋白H1中和靜電電荷和轉(zhuǎn)錄沉默。如前所述，已知特定的表觀遺傳標記與濃縮異染色質(zhì)或開放性常染色質(zhì)相關(guān)。然而，表觀遺傳調(diào)控因子對染色質(zhì)組織的影響尚未完全了解，乙酰化和甲基化的動力學(xué)是否能改變?nèi)旧|(zhì)的凝縮尚不清楚。為了探索這些，并確定觀察到的基質(zhì)剛度對染色質(zhì)凝縮的影響是否是組蛋白甲基化狀態(tài)變化的結(jié)果，作者開發(fā)了一個模擬異染色質(zhì)形成的相場模型。這個模型概括了組蛋白甲基化水平的基質(zhì)依賴性變化如何影響細胞核染色質(zhì)的空間組織的實驗結(jié)果，為乙�；图谆脚c相分離競爭并影響染色質(zhì)組織提供了數(shù)據(jù)支持。
5. 染色質(zhì)在動態(tài)力學(xué)信號下快速重組
現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)剛度通過影響細胞相容性和下游甲基轉(zhuǎn)移酶活性來改變?nèi)旧|(zhì)的組織和定位，但這種靜態(tài)時不變的力學(xué)信號不能復(fù)制主動負載細胞環(huán)境中重構(gòu)的動態(tài)和時變特征。因此，作者接下來研究了生物物理環(huán)境的動態(tài)變化如何影響hMSC的細胞核在納米尺度上的染色質(zhì)組織。作者使用原位基質(zhì)增強系統(tǒng)來評估人骨髓間充質(zhì)干細胞中H2B納米空間組織和染色質(zhì)凝縮的變化。細胞在“硬化水凝膠”系統(tǒng)上培養(yǎng)，該系統(tǒng)提供了基質(zhì)剛度從軟（約3kPa）到硬（約30kPa）的力學(xué)狀態(tài)的快速變化。H2B密度的熱圖顯示，硬化后的最初6小時，染色質(zhì)主要定位于核周邊，硬化后6～48h，染色質(zhì)從核周邊向核內(nèi)部不斷重新分布。染色質(zhì)空間組織的這些變化伴隨著稀疏和致密染色質(zhì)室的凝縮狀態(tài)的持續(xù)下降。
有趣的是，硬化后2h開始凝縮變化，因此在空間組織變化之前，這表明染色質(zhì)的解聚可能導(dǎo)致其在細胞核中的空間重構(gòu)。硬化后18小時，解凝縮量達到起始值的60%左右，并持續(xù)至第7天。作者接下來研究了肌動球蛋白驅(qū)動的收縮力在染色質(zhì)組織和響應(yīng)基質(zhì)硬化的縮合中的作用。數(shù)據(jù)表明，ECM-硬化介導(dǎo)的染色質(zhì)解致密化和從hMSC細胞核邊界到內(nèi)部的再分布需要肌動球蛋白為基礎(chǔ)的細胞收縮。總之，這些數(shù)據(jù)表明，動態(tài)生物物理擾動以復(fù)雜而快速的方式調(diào)節(jié)hMSCs細胞核中的納米尺度的染色質(zhì)組織。
6. “惡化”信號改變hTCs的染色質(zhì)組織
鑒于生物物理信號對體外納米尺度上染色質(zhì)組織的影響的結(jié)果，作者接下來提出了初步假設(shè)：化學(xué)物理環(huán)境（例如軟ECM、缺氧和炎癥）的惡化信號可能引起納米尺度上染色質(zhì)重構(gòu)，并導(dǎo)致年輕健康的hTCs呈現(xiàn)與老年或惡化的（肌腱�。﹉TCs相似的特征。為了驗證這一假設(shè)，作者首先在玻璃、硬（30kPa）或軟（3kPa）基質(zhì)上在基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)從年輕健康供體分離的hTCs 2天。超分辨圖像再次顯示了H2B定位，在玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的年輕健康hTCs的細胞核中形成明顯的H2B納米結(jié)構(gòu)域。有趣的是，年輕hTCs在硬基質(zhì)上培養(yǎng)時，整個細胞核中稀疏和濃縮的染色質(zhì)室的染色質(zhì)凝縮減少，達到與在玻璃基質(zhì)上培養(yǎng)的老年hTCs相似的水平。而在軟基底上培養(yǎng)時，染色質(zhì)重新定位到核周邊并變得更加致密，特別是在核內(nèi)部，這與惡化的hTCs相似�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，肌腱老化或微損傷引起的組織力學(xué)性質(zhì)改變可能會導(dǎo)致疾病中染色質(zhì)組織的一些異常變化。
7. 惡化影響hTCs的力學(xué)靈敏度
鑒于hTCs能夠通過改變?nèi)旧|(zhì)的空間組織和凝縮來迅速應(yīng)對力學(xué)環(huán)境的變化，作者最后研究了組織惡化或老化如何影響其力學(xué)敏感性。超分辨成像結(jié)果顯示，年輕、肌腱病和老年hTCs中的H2B在硬化后4小時內(nèi)主要定位于核周邊。硬化24小時后，年輕hTCs中的染色質(zhì)在整個細胞核中變得更均勻地分散和去致密。老化細胞對基質(zhì)剛度的增加也有相同的反應(yīng)趨勢，但在染色質(zhì)解致密化方面程度較低。然而，當肌腱病變細胞在硬化的水凝膠上培養(yǎng)時，染色質(zhì)的空間組織沒有變化，特別是在核周邊染色質(zhì)失活的程度，與年輕和老年細胞相比明顯更低。這些數(shù)據(jù)表明，hTCs染色質(zhì)組織的長期改變可能與惡化引起的力學(xué)靈敏性喪失有關(guān)。
研 究 結(jié) 論
在這項研究中，基于強大的超分辨率顯微鏡Nanoimager，作者在納米尺度上展示了健康纖維組織和祖細胞細胞核中染色質(zhì)組織對力學(xué)性能具有高度的響應(yīng)性，這種響應(yīng)性依賴于獨特的細胞骨架網(wǎng)絡(luò)和組蛋白修飾的動態(tài)變化，這對如何以及何時應(yīng)用臨床療法治療人類疾病具有重要的指導(dǎo)意義。
Nanoimager
Nanoimager作為新一代單分子成像系統(tǒng)的標志性代表，相比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，在技術(shù)的先進性方面具有巨大突破。它克服了光衍射的限制，橫向分辨率可達20nm、軸向分辨率可達50nm，并支持同時雙色成像和順序四色成像，可在空間上對形態(tài)學(xué)和亞細胞動態(tài)進行精確的納米級研究，進一步揭示分子相互作用細節(jié)，使深入探索變得更簡單。
Nanoimager 集成多種高端成像技術(shù)于一體，具備dSTORM（隨機光學(xué)重建顯微技術(shù)）、PALM（光激活定位顯微技術(shù)）、Single Particle Tracking（單分子動態(tài)追蹤與定量）、smFRET（單分子FRET技術(shù)）和Confocal（共聚焦技術(shù)）等技術(shù)模塊，這些優(yōu)勢使它成為信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤和外泌體標志物、病毒增殖和裝配、細胞亞顯微結(jié)構(gòu)表征等研究領(lǐng)域在單分子水平上進行顯微分析的重要幫手。
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