熒光超分辨顯微術(shù)淺析與活細(xì)胞超分辨成像新進(jìn)展
本文作者：錢(qián)佳銘博士
南京理工大學(xué)智能計(jì)算成像實(shí)驗(yàn)室
光學(xué)顯微鏡
光學(xué)顯微鏡（optical microscopy），顧名思義，是通過(guò)光學(xué)手段將人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)的光學(xué)儀器。如今，光學(xué)顯微鏡已發(fā)展成為許多基礎(chǔ)研究和工程應(yīng)用中的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)、納米技術(shù)、工業(yè)檢測(cè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，為人類(lèi)的發(fā)展做出了不可磨滅的重大貢獻(xiàn)。早在三百多年前，人類(lèi)就已經(jīng)使用光學(xué)顯微鏡觀察肉眼無(wú)法分辨的微觀物體。1662年，英國(guó)物理學(xué)家羅伯特·胡克（Robert Hooke，1635—1703年）使用自制的顯微鏡觀察軟木切片，發(fā)現(xiàn)其在放大后呈現(xiàn)出類(lèi)似修道院?jiǎn)稳司邮业奈⒂^結(jié)構(gòu)，并以拉丁語(yǔ)“Cella”（“細(xì)胞”英文單詞“Cell”的由來(lái)）命名這些結(jié)構(gòu)，意為“小房間”或“小隔間”。這是人類(lèi)歷史上第一次觀察到細(xì)胞。
圖2 列文虎克制作的顯微鏡及記錄手稿。(a) 列文虎克制作的顯微鏡，先存于烏得勒支大學(xué)博物館。(b) 列文虎克繪制的細(xì)菌。(c) 列文虎克寄給英國(guó)皇家學(xué)會(huì)的書(shū)信之一
圖3 不同時(shí)期的奧林巴斯顯微鏡。依次為1920年“旭號(hào)”顯微鏡、1927年“昭和號(hào)”顯微鏡、1980年“BH2”系列顯微鏡、1983年“AH2”系列顯微鏡、1993年“BX”系列顯微鏡、1996年“MX50”顯微鏡、“IX3”系列研究型倒置顯微鏡、IXplore spinSR超分辨共聚焦顯微鏡
超分辨熒光顯微成像技術(shù)
1873年，德國(guó)物理學(xué)家恩斯特·阿貝（Ernst Karl Abbe，1840—1905年）提出了光學(xué)成像系統(tǒng)的衍射極限理論，指出光學(xué)顯微鏡的分辨率極限大約是可見(jiàn)光波長(zhǎng)的一半（約200nm），這被稱(chēng)為“阿貝極限”1,2。該問(wèn)題困擾著科學(xué)家長(zhǎng)達(dá)一個(gè)世紀(jì)之久，這一時(shí)期光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用一直被限制在細(xì)胞水平而無(wú)法在亞細(xì)胞層面進(jìn)行高分辨成像。
圖4 2014年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科學(xué)家，以表彰他們對(duì)超分辨率熒光顯微成像技術(shù)的重大貢獻(xiàn)
· 單分子定位的顯微術(shù)
在基于單分子定位的超分辨顯微成像技術(shù)中，PALM由2014年諾貝爾獎(jiǎng)得主之一Betzig8提出，該技術(shù)基于熒光分子的光轉(zhuǎn)化能力和單分子定位，通過(guò)用光控制每次僅有少量隨機(jī)離散的單個(gè)熒光分子發(fā)光，并準(zhǔn)確定位單個(gè)熒光分子點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心，最終利用多次曝光疊加成一幅超高分辨率圖像（圖5）。
由Hess9提出的熒光活化定位顯微術(shù)（fluorescence photoactivation localization microscopy, fPALM）與PLAM原理相似，熒光團(tuán)經(jīng)探測(cè)器成像后，由光強(qiáng)控制熒光分子被可逆地滅活或不可逆地光漂白而從視場(chǎng)中消失。由Zhuang等10提出的STORM技術(shù)與PALM技術(shù)在原理上類(lèi)似，其利用化學(xué)小分子Cy3和Cy5、Cy7等熒光分子對(duì)的光轉(zhuǎn)換效應(yīng)同樣可以達(dá)到突破光學(xué)極限的效果。與PALM區(qū)別在于其所利用的探針是化學(xué)小分子而不是生物大分子。因此，STORM需要利用熒光發(fā)色團(tuán)標(biāo)記抗體對(duì)靶蛋白進(jìn)行識(shí)別，可以檢測(cè)到內(nèi)源性蛋白，避免PALM中由于外源性表達(dá)偶聯(lián)熒光蛋白的靶蛋白對(duì)其定位產(chǎn)生的可能的影響。2014年，三個(gè)小組分別報(bào)道了互補(bǔ)式可激活型熒光蛋白系統(tǒng)，在哺乳動(dòng)物（PAGFP11和PAmCherry12）和大腸桿菌中（mEos3.213）實(shí)現(xiàn)了熒光互補(bǔ)和超高分辨率成像，對(duì)二聚化或相互作用蛋白的超高分辨率成像具有重要應(yīng)用價(jià)值�；趩畏肿佣ㄎ坏某直骘@微成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)10~30nm的橫向分辨率，但由于反復(fù)激活和淬滅熒光分子，所需時(shí)間長(zhǎng)，其時(shí)間分辨率較低。
圖5 PALM原理示意圖與結(jié)果圖。(a)-(c) PALM原理示意圖，其中圖(a)為探測(cè)的單個(gè)原始光子圖像，圖(b)對(duì)對(duì)圖(a)的高斯擬合，圖(c)為定位的圖(a)的中心。(d) 聚苯乙烯微球的寬場(chǎng)圖像。(e) 疊加原始PALM堆棧數(shù)據(jù)中單分子圖像所獲取的聚苯乙烯微球圖像。(f) 聚苯乙烯微球的PALM超分辨圖像
圖6 STED的超分辨原理示意圖和結(jié)果圖16。(a) STED典型光學(xué)系統(tǒng)。(b) STED超分辨原理。(c) 微管寬場(chǎng)圖
另一種典型的基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨技術(shù)是SIM技術(shù)。如前所述，成像系統(tǒng)的分辨率受到阿貝衍射極限的限制，存在接近波長(zhǎng)一半尺度的衍射極限，物場(chǎng)信息中高于此光學(xué)傳遞函數(shù)截止頻率的成分將會(huì)被濾除。針對(duì)這一問(wèn)題，Gustafsson18于2000年提出了SIM技術(shù)，其基本原理是通過(guò)結(jié)構(gòu)化照明在頻域以空間混頻的方式將物體高頻信息載入光學(xué)系統(tǒng)的探測(cè)通帶內(nèi)實(shí)現(xiàn)突破阿貝衍射極限的超分辨光學(xué)顯微成像。當(dāng)利用周期性結(jié)構(gòu)正弦照明光激發(fā)樣品時(shí)，在頻域上由于結(jié)構(gòu)光頻譜與物頻譜的卷積而產(chǎn)生攜帶物體信息的多級(jí)頻譜。其中±1級(jí)頻譜將攜帶物體細(xì)節(jié)信息的高頻部分平移至截止頻率范圍內(nèi)而被探測(cè)，如圖7所示。但這些高頻信息與0級(jí)頻譜的低頻信息疊加在一起，需要后期數(shù)據(jù)處理（如相移、反卷積、參數(shù)估計(jì)等）將三級(jí)頻譜分開(kāi)才能有效獲得樣品的高頻信息19。由于結(jié)構(gòu)光條紋照射在樣品上也受到系統(tǒng)衍射限制，因此等效截止頻率最多可拓展一倍，即SIM的分辨率最多能在衍射極限基礎(chǔ)上提高一倍，達(dá)到非相干衍射極限的2倍，約在100nm20。盡管SIM對(duì)橫向分辨率的提升不如PALM、STORM、STED等技術(shù)，但其高的光子效率、較快的成像速度和全場(chǎng)成像等優(yōu)點(diǎn)使得其非常適合進(jìn)行活細(xì)胞的超分辨成像。值得注意的是，光柵衍射效應(yīng)不僅僅限于±1級(jí)頻譜，例如矩形光柵的頻譜就要豐富得多，其還包括±2級(jí)、±3級(jí)等高階頻譜。
因此，假如能采用矩形光柵作為結(jié)構(gòu)光，則可以產(chǎn)生多級(jí)頻譜，使等效截止頻率得到多次拓展從而大幅提高分辨率。但由于結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生也受到光學(xué)系統(tǒng)有限孔徑的限制，直接在物平面上形成一個(gè)周期接近衍射極限分辨率的矩形光柵并不現(xiàn)實(shí)。針對(duì)此問(wèn)題，Gustafsson21在傳統(tǒng)SIM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出了飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（saturated SIM，SSIM），巧妙地利用熒光分子的飽和激發(fā)使樣品在正弦光波激發(fā)下發(fā)出具有高階頻率分量的非正弦結(jié)構(gòu)光，從而實(shí)現(xiàn)多級(jí)頻譜拓展[如圖7(b)]，將分辨率提高到了約50nm的水平。然而飽和照明所需的高強(qiáng)度激光增加了SSIM的光毒性與光漂白，無(wú)法發(fā)揮SIM高光子效率、低光損傷的優(yōu)勢(shì)，使其難以運(yùn)用于活細(xì)胞成像，因此并未得到廣泛應(yīng)用。
實(shí)時(shí)活細(xì)胞超分辨顯微成像
近日，來(lái)自南京理工大學(xué)的陳錢(qián)、左超教授課題組提出一種高效、魯棒的基于主成分分析的結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（PCA-SIM），首次實(shí)現(xiàn)了在有外界干擾的復(fù)雜、低信噪比實(shí)驗(yàn)環(huán)境下對(duì)照明參數(shù)的快速自適應(yīng)精準(zhǔn)補(bǔ)償和對(duì)活細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的實(shí)時(shí)、高質(zhì)量動(dòng)態(tài)超分辨成像31。他們發(fā)現(xiàn)，理想無(wú)干擾條件下的結(jié)構(gòu)光照明相量矩陣應(yīng)是一個(gè)秩-1矩陣，其僅包括一個(gè)“主成分”，在最小二乘意義上描述了相量矩陣處于一個(gè)單一維度的“特征子空間”。然而，由于噪聲、光學(xué)像差、樣品非均勻調(diào)制度等干擾因素，通常情況下實(shí)驗(yàn)上所獲得的相量矩陣會(huì)存在不規(guī)則的高維分量。如何消除這些高維干擾分量以獲得對(duì)應(yīng)理想照明相量矩陣中單一“主成分”，將是低信噪比條件下進(jìn)行SIM準(zhǔn)確參數(shù)估計(jì)的關(guān)鍵。
研究者基于PCA-SIM實(shí)現(xiàn)了對(duì)活體COS-7細(xì)胞線粒體的實(shí)時(shí)超分辨成像，依靠的平臺(tái)是基于奧林巴斯IX73倒置熒光顯微鏡自主搭建的三色干涉式SIM超分辨儀器（圖9）。圖10給出了部分實(shí)時(shí)觀測(cè)的活體COS-7細(xì)胞的線粒體動(dòng)態(tài)小管事件（mitochondrial dynamic tubulation，MDT）。如圖10(a)-10(b)，細(xì)長(zhǎng)且高度動(dòng)態(tài)的MDT小管從線粒體中不斷延伸，并與其他線粒體發(fā)生融合，形成了兩個(gè)線粒體之前的膜橋。隨后MDT小管逐漸增厚并趨于穩(wěn)定，最終構(gòu)成線粒體網(wǎng)絡(luò)。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象對(duì)研究線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成以及線粒體功能（如線粒體DNA完整性、細(xì)胞凋亡等）的維持具有重要意義。PCA-SIM為研究活細(xì)胞中納米尺度結(jié)構(gòu)演化、細(xì)胞器互作和生物分子動(dòng)力學(xué)信息提供了一種快速實(shí)時(shí)、靈活便捷、低光損傷的成像新手段，在生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
產(chǎn)品介紹
【IX3系列研究級(jí)倒置顯微鏡】
IX3系列(IX53/73/83)作為能提供活細(xì)胞成像的高度可擴(kuò)展的光學(xué)平臺(tái)，其建立在雄厚的技術(shù)基礎(chǔ)之上，擁有靈活的結(jié)構(gòu)，容易利用的光路，提供高分辨，高反差的寬場(chǎng)圖像。一切設(shè)計(jì)基于用戶的心聲，科學(xué)家的工作流程需要，廣泛應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，分子生物學(xué)，光生物學(xué)等領(lǐng)域，將成為科研工作者進(jìn)行更高水平的活細(xì)胞研究的有力武器。
X Line（翼系列）平場(chǎng)二代超復(fù)消色差物鏡(PlanXApo)，在平場(chǎng)超復(fù)消色差（PlanSApo）物鏡的技術(shù)基礎(chǔ)上突破創(chuàng)新，在平場(chǎng)性、色差矯正和分辨率三項(xiàng)技術(shù)的層面兼收并舉，同時(shí)囊括三項(xiàng)技術(shù)的尖端參數(shù)要求，滿足高質(zhì)量、大視場(chǎng)、高分辨率精確成像的要求，可以說(shuō)，一枚物鏡就可以讓我們看得更多、更細(xì)、更美，也更自由。
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