胰腺癌(PDA)是一種致命的惡性腫瘤，5年生存率為11%。由于胰腺癌中存在廣泛的腫瘤微環(huán)境(TME），即便使用最新的免疫療法，患者的最終治愈率依然低下。先前的報(bào)道顯示，胰導(dǎo)管腺癌的發(fā)生與WNT信號(hào)的激活有關(guān)，但是信號(hào)通路的激活與腫瘤微環(huán)境之間的調(diào)控關(guān)系尚不清楚。來自美國密歇根大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Experimental Medicine（IF 17.579）上發(fā)表題為“WNT signaling in the tumor microenvironment promotes immunosuppression in murine pancreatic cancer”的文章。該文章應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)胰腺癌樣本進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)的解析了表達(dá)Tcf7的CD4+T細(xì)胞通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境的改變，引起PD-L1+細(xì)胞的代償性增加。然后，作者在動(dòng)物模型中，使用WNT信號(hào)抑制劑聯(lián)合靶向PD-L1治療方案，成功降低了胰腺癌的生長。這一研究成果也為臨床治療胰腺癌提供了新的指導(dǎo)方案。
 

 

研究材料

16個(gè)樣本的PDA患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（PDA組織和配對(duì)的血液樣本）
3個(gè)樣本的小鼠的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（組織樣本）

 

技術(shù)路線

步驟1：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證了Tcf7在人和小鼠PDA的CD4+ T細(xì)胞中的保守性；

步驟2：敲除Tcf7可以通過抑制CD4+T細(xì)胞的免疫功能改變腫瘤微環(huán)境；

步驟3：敲除Tcf7可以調(diào)控PD-L1+髓細(xì)胞細(xì)胞代償性的增加;

步驟4：實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抑制WNT信號(hào)通路對(duì)PDA的治療效果。

 

研究結(jié)果

1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證了Tcf7在人和小鼠PDA的CD4+ T細(xì)胞中的保守性

為了了解WNT通路在胰腺中的表達(dá)情況，作者選擇了課題組先前發(fā)表的臨床PDA組織的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。然后在單細(xì)胞的結(jié)果上展示了WNT通路中基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Tcf7基因（編碼TCF1蛋白）在CD4+T細(xì)胞中表達(dá)量最高。并且在這16個(gè)PDA患者配對(duì)的PBMC樣本中展示出了同樣的現(xiàn)象。為了確定Tcf7的表達(dá)模式具有物種保守性，作者又選擇了3只小鼠（healthy=2，mPDA=1）進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，通過數(shù)據(jù)分析共鑒定出了15種細(xì)胞類型。進(jìn)一步分析顯示，相比較健康的小鼠，Tcf7基因在mPDA模型CD4+T細(xì)胞中表達(dá)的水平更高。這一結(jié)果與患者樣本的單細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果相吻合。
 

圖1 Tcf7在人和小鼠PDA的CD4+ T細(xì)胞中普遍存在

 

2. 敲除Tcf7可以通過抑制CD4+T細(xì)胞的免疫功能改變腫瘤微環(huán)境

TCF1最初被認(rèn)為是T淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在T細(xì)胞的發(fā)育和分化中起著關(guān)鍵作用。因此，基于單細(xì)胞的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，作者設(shè)想TCF1在PDA中具有調(diào)節(jié)CD4+ T細(xì)胞的免疫抑制功能。接下來，作者設(shè)計(jì)了Tcf7敲除模型。經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的腫瘤生長顯著降低。通過IHC和流式分選等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了CD4+ T細(xì)胞的免疫抑制功能可能由TCF1介導(dǎo)。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出了Tcf7在調(diào)控CD4+T細(xì)胞改變腫瘤微環(huán)境的重要作用。

 

圖2 CD4+ T細(xì)胞中的TCF1信號(hào)通路介導(dǎo)其免疫抑制潛能

接下來，作者設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的Tcf7敲除模型小鼠進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。分析結(jié)果顯示Tcf7在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)水平最高。為了探索Tcf7失活后T細(xì)胞的變化，作者對(duì)Cd3e表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行了亞群再聚類分析，并確定了11個(gè)不同的cluster。進(jìn)一步的比較分析顯示了在Tcf7缺失模型組中，Treg細(xì)胞顯著減少，而Th17細(xì)胞顯著增加。隨后，作者通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論，從而，揭示了Tcf7的失活抑制Treg細(xì)胞分化，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的作用。

 

圖3 CD4+ T細(xì)胞中的TCF1信號(hào)通路促進(jìn)PDA中的Treg分化 

 

3.  敲除Tcf7可以調(diào)控PD-L1+髓細(xì)胞細(xì)胞代償性的增加

接下來，為了確定CD4+ T細(xì)胞中Tcf7的失活是否改變了PDA TME中髓系細(xì)胞的組成，作者對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行了亞群再聚類，共鑒定出6種細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞在兩組模型中的變化顯著。然后作者研究了髓系細(xì)胞免疫抑制的潛力，然而不同的髓系細(xì)胞亞群在兩組間的Cd274(PD-L1)表達(dá)水平相似，但是Arg1和Nos2的表達(dá)水平在敲除組中更高。這些結(jié)果提示了敲除Tcf7導(dǎo)致了免疫抑制表型增強(qiáng)。這一結(jié)果與作者之前觀測(cè)到的結(jié)果相吻合。隨后，作者通過質(zhì)譜流(CyTOF)技術(shù)再次驗(yàn)證了這一結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在CyTOF的結(jié)果中，Tcf7敲除組的PD-L1的髓系細(xì)胞數(shù)量增加。因此，作者推測(cè)PD-L1+細(xì)胞的增加是否可以作為治療胰腺癌的靶點(diǎn)。
 

圖4 CD4+ T細(xì)胞中TCF1的缺失導(dǎo)致MDSCs的代償性增加
 

先前的報(bào)道顯示，在一些腫瘤中存在IL-17與PD-L1的表達(dá)相關(guān)。因此，作者在骨髓來源的髓系前體細(xì)胞(BMDMs)上測(cè)試了IL-17是否調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17A會(huì)導(dǎo)致Cd274、Arg1和Nos2的高表達(dá)。然而這一結(jié)果卻沒能在PDA模型的細(xì)胞系中重現(xiàn)。隨后，作者設(shè)計(jì)了細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了TCF1缺失的CD4+ T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。
 

圖5 CD4+ T細(xì)胞中TCF1的缺失驅(qū)動(dòng)髓細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)

 

4.  實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抑制WNT信號(hào)對(duì)PDA的治療效果

作者先前的數(shù)據(jù)表明了WNT通路在上皮細(xì)胞中參與對(duì)腫瘤的支持作用。作者設(shè)計(jì)使用能夠抑制WNT信號(hào)通路的PORCN抑制劑(PORCNi)，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組或PORCNi組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PORCNi治療后的小鼠腫瘤更小。然后，作者通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了WNT信號(hào)的抑制作用是否改變了腫瘤的微環(huán)境。結(jié)果觀察到在PORCNi治療后的小鼠中Total T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞浸潤的增加。隨后，作者又通過抗CD8和抗PD-L1進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)抑制WNT信號(hào)可以使PDA對(duì)PD-L1阻斷敏感，表明聯(lián)合靶向可以降低胰腺癌的生長，并可能有益于胰腺癌的治療。
 

圖6 抑制WNT信號(hào)可以提高了PD-L1阻斷的療效

 

 小編小結(jié)

作者在先前大量的研究中報(bào)道了WNT信號(hào)在上皮細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞中具有活性，并有助于阻斷CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性。因此，在本次研究內(nèi)容中，作者采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)PDA患者和模型小鼠的胰腺癌腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，詳細(xì)的描述了CD4+ T細(xì)胞中Tcf7的失活以特異性的方式抑制WNT信號(hào)，從而激活 CD8+ T細(xì)胞效應(yīng)功能來抑制腫瘤進(jìn)展。但是表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞和髓系細(xì)胞的數(shù)量也得到代償性增加。通過藥物抑制在腫瘤細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞中抑制WNT信號(hào)，聯(lián)合PD-L1治療可以有效抑制腫瘤生長。這一研究成果或許可以為胰腺癌的臨床治療提供新的解決方案。

 

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