4D-Labelfree磷酸化--國際竹藤研究中心揭示毛竹生長素調(diào)控途徑

生長素是植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑，它參與細(xì)胞發(fā)育過程、調(diào)節(jié)植物-環(huán)境相互作用、影響器官發(fā)育。生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由生長素外排和內(nèi)流載體蛋白控制，在生長素外排過程中起重要作用的一種二級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為，PIN-formed (PIN)蛋白，其極性決定了細(xì)胞間生長素流動的方向性。毛竹作為中國分布最廣且最具經(jīng)濟(jì)價值的竹種，目前對于其體內(nèi)PIN蛋白的認(rèn)知依然較淺、研究也不深入，長生素運(yùn)輸在毛竹中的作用目前也不清楚。

2023年2月，國家林業(yè)和草原局北京竹藤科學(xué)技術(shù)重點實驗室高健教授研究團(tuán)隊在International Journal of Biological Macromolecules（IF 8.025）雜志上發(fā)表了題為“Phylogeny, transcriptional profile, and auxin-induced phosphorylation modification characteristics of conserved PIN proteins in Moso bamboo (Phyllostachys edulis)”的研究論文，該研究獲得了毛竹中的PIN基因，并對起進(jìn)行了理化、結(jié)構(gòu)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。同時采用轉(zhuǎn)錄組揭示了PIN1亞家族的調(diào)控作用、采用4D-Labelfree磷酸化修飾組發(fā)現(xiàn)了PIN蛋白和蛋白激酶的磷酸化過程響應(yīng)生長素的調(diào)節(jié)，并構(gòu)建了一個以PIN蛋白為核心的植物激素相互作用網(wǎng)絡(luò)。中科新生命為該研究提供了4D-Labelfree磷酸化修飾組技術(shù)服務(wù)。

 

 

研究材料

不同生長時期、不同處理方式的的毛竹竹筍，毛竹不同部位的組織（葉片、花芽、根莖尖等）

 

 技術(shù)路線

步驟1：毛竹PIN基因家族的鑒定、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析；

步驟2：PIN基因家族的染色體分布、共向進(jìn)化關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育樹分析；

步驟3：轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qRT-PCR方法分析PIN基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式；

步驟4：生長素誘導(dǎo)的毛竹中PIN蛋白磷酸化修飾組分析；

步驟5：以PIN蛋白為中心的植物激素整合調(diào)控模型分析。

 

 研究內(nèi)容

1. 毛竹PIN基因家族的鑒定、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

為了鑒定毛竹中的候選PIN基因，將擬南芥和水稻的PIN蛋白序列與毛竹基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，共得到23條PIN基因序列。對這些PIN基因家族的啟動子區(qū)域、順式作用元件和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)PIN家族均含有植物激素相關(guān)響應(yīng)元件、光響應(yīng)和myb結(jié)合元件，表明竹子的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)和光信號通路密切相關(guān)，并受到MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。但是不同PIN亞家族間（PIN1、PIN2和PIN9亞家族與PIN5、PIN8亞家族）motif、結(jié)構(gòu)域和外顯子數(shù)量上不一致，這也導(dǎo)致了毛竹PIN基因的功能特異性（圖1）。另外，由于PIN蛋白作為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性，其空間結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，作者分析了PIN蛋白家族的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛竹中很多PIN蛋白均可以特異性結(jié)合生長素，揭示不同的PIN蛋白在不同時間或在不同器官負(fù)責(zé)生長素的運(yùn)輸（圖2）。
 

 

圖2 PIN蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

 

2. PIN基因家族的染色體分布、共向進(jìn)化關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

進(jìn)化過程中基因家族的擴(kuò)張和收縮會影響基因結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響基因功能的分化，作者分析了毛竹PIN基因（PhePIN）家族的基因組同線群和比較共聯(lián)圖。研究發(fā)現(xiàn)分布在不同的染色體上的PIN基因的復(fù)制并導(dǎo)致毛竹中PIN家族基因的數(shù)量遠(yuǎn)高于水稻和擬南芥。全基因組水平上構(gòu)建的水稻、玉米和馬竹的比較共聯(lián)圖譜，發(fā)現(xiàn)毛竹的17個PhePIN基因與這3個物種的基因具有共線關(guān)系，表明這些基因在進(jìn)化早期就出現(xiàn)并穩(wěn)定存在。毛竹PIN基因在進(jìn)化上較為保守(圖3)。
 

為了研究毛竹PIN基因家族的系統(tǒng)發(fā)育模式，作者選取了水稻、玉米、擬南芥等物種中的PIN基因、不同竹科的PIN基因分別與毛竹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示PhePIN基因相對保守，在竹亞科內(nèi)親緣關(guān)系較近（圖4A）。另外，在竹科中，由于染色體倍性變化不大，其生物學(xué)功能可能更為集中和相似（圖4B）。
 

圖4 毛竹PIN基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

 

3. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qRT-PCR方法分析PIN基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式

為了研究PIN基因家族的生物學(xué)功能，作者采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對不同毛竹組織（圖5A）、不同生長發(fā)育階段的竹筍（圖5B）、不同處理方式的竹筍（圖5C）中的PIN基因的表達(dá)模式分別進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PhePIN1亞家族和PhePIN9-5基因在所有數(shù)據(jù)中均特異性的高表達(dá)，其他基因在不同發(fā)育階段、不同組織、不同處理中均有不同程度的特異性表達(dá)。

為了確定PIN基因的表達(dá)模式，作者采用3個月大的幼苗的根、莖和葉進(jìn)行了qRT-PCR (圖6)。研究發(fā)現(xiàn)PIN1亞家族決定了不同PIN亞家族的主要調(diào)控作用，該發(fā)現(xiàn)證實了生長素合成與作用位點的不一致可能是由于PIN蛋白的極性轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控。此外，對不同生長發(fā)育階段的竹筍的上部、中部和基部進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PIN基因在不同發(fā)育階段處于不同的作用位置，表明生長素在快速生長期的作用位置與快速生長期之前的位置不一樣。

 

圖6 qRT-PCR驗證PIN基因表達(dá)模式

 

4. 生長素誘導(dǎo)的毛竹中PIN蛋白磷酸化修飾組分析

PIN蛋白介導(dǎo)的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要通過蛋白磷酸化級聯(lián)途徑產(chǎn)生。為研究PIN蛋白在生長素調(diào)控竹子快速生長過程中的作用，作者采用4D-Labelfree磷酸化修飾組對生長素處理的毛竹快速生長期(筍高4m)第18節(jié)間進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾主要發(fā)生在PIN1亞家族中的PhePIN2-1和PhePIN9-5蛋白上，多個磷酸化激酶也發(fā)生了磷酸化修飾。磷酸化修飾肽的保守motif基序分析發(fā)現(xiàn)在毛竹中主要的基序是[S_PxxxxK]、[xKxxxS_Pxxxx]、[xxxxxS_PxxxxxG]、[xxxxxx_S_PRxxxx]、[xxxxxs_pxxxxx]和[xxxxx_S_Pxxxxx]，與報道的motif不同。綜上所述，PIN蛋白及其相關(guān)蛋白的磷酸化修飾是生長素誘導(dǎo)修飾的重要組成部分，PIN1蛋白亞家族在PIN蛋白中起主要的磷酸化作用。竹子的特異性決定了其保守磷酸化motif基序的差異。

 

圖7 生長素誘導(dǎo)的毛竹中PIN蛋白磷酸化修飾組分析

 

5. 以PIN蛋白為中心的植物激素整合調(diào)控模型分析

為了研究PIN蛋白介導(dǎo)的激素間調(diào)節(jié)模式，作者通過同源比對鑒定了毛竹中所有已報道的植物激素家族成員及其相關(guān)蛋白激酶，然后利用獲得的蛋白質(zhì)序列和STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白間互作關(guān)系以及篩選與毛竹PIN蛋白的互作蛋白（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)互作蛋白網(wǎng)絡(luò)中涉及7個PIN蛋白，且PIN蛋白的調(diào)控蛋白主要集中在生長素信號通路中。乙烯、脫落酸和赤霉素信號通路參與了PIN蛋白的調(diào)控。4種蛋白激酶參與PIN蛋白的相互調(diào)控。

 

圖8 毛竹中PIN蛋白相互作用蛋白預(yù)測

 

小結(jié)

生長素的極性轉(zhuǎn)運(yùn)是生長素發(fā)揮其功能的重要途徑，生長素在毛竹的快速生長中起著不可替代的作用。作者對毛竹中PIN-FORMED生長素外流載體進(jìn)行了鑒定和結(jié)構(gòu)分析，從5個基因亞家族中獲得了23個PhePIN基因。對216個PIN基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PIN基因在竹科進(jìn)化中相對保守，在毛竹中經(jīng)歷了科內(nèi)段復(fù)制。PIN基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，PIN1亞家族起著主要的調(diào)控作用。PIN基因與生長素生物合成在時空分布上保持高度一致。磷酸化蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)許多磷酸化蛋白激酶通過自磷酸化和PIN蛋白磷酸化響應(yīng)生長素調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示存在一個以PIN蛋白為核心的植物激素相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該研究提供了一個全面的PIN蛋白分析，補(bǔ)充了毛竹的生長素調(diào)控途徑，為進(jìn)一步研究竹子的生長素調(diào)控鋪平了道路。

 

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