青光眼是一種視神經(jīng)病變，全世界約6000萬(wàn)人受到影響，是目前導(dǎo)致不可逆失明的最常見(jiàn)疾病之一。高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)丟失、軸突變性與青光眼發(fā)病的機(jī)制有關(guān)，青光眼視神經(jīng)病變除了高眼壓外還與其他多種因素相關(guān)。目前，青光眼的藥物治療僅限于降眼壓劑;因此，為了保護(hù)RGCs免受有害因素影響，急需新藥研發(fā)。為了加快青光眼藥物的研發(fā)，有必要研究青光眼的病理生理和分子機(jī)制。G蛋白偶聯(lián)受體3 (GPR3)可促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活，然而，GPR3在視神經(jīng)元損傷后軸突再生中的潛在作用尚未闡明。
 

為了弄清該病的病理及其分子機(jī)制，日本廣島大學(xué)的研究人員研究了小鼠視網(wǎng)膜損傷后GPR3在小鼠RGCs中的表達(dá)及參與的軸突再生機(jī)制。研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名科學(xué)期刊Neurobiology of Disease上發(fā)表了題為“GPR3 expression in retinal ganglion cells contributes to neuron survival and accelerates axonal regeneration after optic nerve crush in mice ”的文章，研究表明，GPR3在RGCs中的表達(dá)有助于維持小鼠視神經(jīng)擠壓（ONC）后神經(jīng)元的存活并且聯(lián)合酵母聚糖處理可進(jìn)一步增強(qiáng)再生軸突的作用。
 

神經(jīng)元損失是由損傷后細(xì)胞內(nèi)cAMP下調(diào)引起的，cAMP下調(diào)降低了特定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的反應(yīng)性，從而導(dǎo)致RGCs死亡。GPR3在各類神經(jīng)元中均有表達(dá)，獨(dú)特之處在于它在沒(méi)有配體的情況下激活Gαs蛋白，從而增加細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平。cAMP的升高可以增強(qiáng)由酶母聚糖、腫瘤調(diào)節(jié)素或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的軸突再生。因此，細(xì)胞內(nèi)cAMP升高對(duì)神經(jīng)元存活與生長(zhǎng)具有多模式影響并對(duì)軸突損傷后神經(jīng)元再生具有重要作用。由于視網(wǎng)膜免疫染色需要強(qiáng)滲透處理，因此，作者利用CRISPR- Cas9基因組編輯技術(shù)生成了PA標(biāo)記的GPR3轉(zhuǎn)基因小鼠。制備crRNA-tracrRNA復(fù)合物，然后將Cas9酶、crRNA-tracrRNA和ssodn以100、200和400 μg/μl的最終濃度混合。使用NEPA 21（NEPA GENE）電轉(zhuǎn)染儀將Cas9酶、gRNA和ssodn的混合物轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎中以便觀察GPR3在視網(wǎng)膜上的分布與表達(dá)情況。結(jié)果顯示視網(wǎng)膜中，GPR3在RGCs、ONL和INL神經(jīng)元中均表達(dá)，在無(wú)分泌細(xì)胞中表達(dá)稀疏。視網(wǎng)膜中GPR3的表達(dá)與中樞神經(jīng)細(xì)胞中GPR3的表達(dá)趨勢(shì)相似（圖1）。

圖1、GPR3在小鼠視網(wǎng)膜中具備高表達(dá)

為了研究GPR3在RGC存活過(guò)程中的作用，通過(guò)評(píng)估RGCs數(shù)量和內(nèi)網(wǎng)織層（IPL）厚度來(lái)確定RGC活力。與野生型小鼠相比，早在10-12周齡時(shí)，GPR3敲除小鼠的RGCs數(shù)量和IPL厚度顯著減少。在野生型小鼠中，與10-12周齡相比，50-60周齡時(shí)RGCs數(shù)量明顯減少。此外，在50-60周齡的GPR3敲除小鼠中也觀察到RGCs數(shù)量的減少。這些結(jié)果表明，GPR3在RGC中的表達(dá)與RGC在衰老過(guò)程中的生存有關(guān)，但對(duì)眼壓無(wú)影響（圖2）。
 

圖2、GPR3在RGCs衰老過(guò)程中的表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)作用

為了包裝腺相關(guān)病毒（AAV）， PAAV質(zhì)粒、Rep2-Cap2質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒使用NEPA21電轉(zhuǎn)染儀(Nepa Gene)共轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，從細(xì)胞和培養(yǎng)基中收集包裝好的AAV載體，然后進(jìn)行純化。為增加載體濃度，將復(fù)合材料應(yīng)用于Vivaspin色譜柱(VS2041;感染前1天，HEK293細(xì)胞以2.0 × 10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的比例在24孔板中培養(yǎng)，以評(píng)估滴度。轉(zhuǎn)染3天后固定細(xì)胞，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)gfp陽(yáng)性細(xì)胞，每種AAV的效價(jià)分為三份并計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU/ml)，得到本研究使用的AAV病毒滴度:rAAV-Mock 10 × 10¹⁰ TU/ml和rAAV-GPR3 8 × 10¹⁰ TU/ml。為了評(píng)估軸突再生，6周齡雄性野生型小鼠(C57BL/6)在ONC前2周使用玻璃拉桿制成的尖尖玻璃毛細(xì)管靜脈注射1 μl rAAV-Mock或rAAV-GPR3。為了評(píng)估GPR3和酵母聚糖的聯(lián)合作用，在ONC后立即仔細(xì)地靜脈注射1 μl酵母聚糖 。陽(yáng)性對(duì)照組在ONC后立即同時(shí)注射1 μl 酵母聚糖。摘除眼睛，在去核前兩天，順行示蹤劑以可視化再生的RGC軸突。然后用低溫恒溫器將固定的視網(wǎng)膜矢狀切片成14 μm厚的切片，為了評(píng)估再生軸突的數(shù)量，作者在距離粉碎部位4種不同距離處量化再生軸突的數(shù)量。對(duì)野生型或GPR3基因敲除小鼠的眼睛進(jìn)行ONC，手術(shù)后立即在眶內(nèi)給藥酵母聚糖，神經(jīng)損傷后28天用熒光順行示蹤劑評(píng)估軸突再生。結(jié)果表明，在野生型小鼠中，酵母聚糖影響軸突再生。然而，在GPR3基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜中，酶多糖介導(dǎo)的軸突再生被顯著抑制。當(dāng)聯(lián)合酵母聚糖時(shí)，GPR3在ONC后軸突再生中起作用（圖3）。

圖3、GPR3參與視神經(jīng)擠壓（ONC）后的軸突再生

基于其他報(bào)道稱暴露于各種缺血刺激后，GPR3參與CGNs神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活。因此，為了確定GPR3表達(dá)是否在RGCs的神經(jīng)突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活中發(fā)揮類似的作用。RGCs在培養(yǎng)前表現(xiàn)出微弱的GPR3表達(dá);然而，直到培養(yǎng)7天，GPR3的表達(dá)逐漸增加(圖4.A-B)，這與原代培養(yǎng)的CGNs中GPR3的表達(dá)趨勢(shì)相似。當(dāng)GPR3表達(dá)為與對(duì)照組相比，siRNA抑制RGCs中GPR3的表達(dá)顯著降低(圖2.A).在對(duì)照組siRNA處理的RGCs中，神經(jīng)突出增加，直到培養(yǎng)48小時(shí)。然而，當(dāng)GPR3 siRNA抑制了固有的GPR3表達(dá)時(shí)，RGC神經(jīng)突在培養(yǎng)24或48小時(shí)被顯著抑制(圖4.C-D)。此外，與對(duì)照組siRNA處理的RGCs相比，在培養(yǎng)24或48小時(shí)，GPR3 siRNA處理的RGCs的RGC存活率顯著降低(圖4.G-H)。

相反，當(dāng)用表達(dá)GPR3的載體轉(zhuǎn)染RGCs時(shí)，GPR3的表達(dá)與模擬載體轉(zhuǎn)染RGCs相比顯著增加。與模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，GPR3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的RGCs中的神經(jīng)突顯著增加這些結(jié)果表明，GPR3在培養(yǎng)的RGCs中的表達(dá)促進(jìn)了神經(jīng)突的生長(zhǎng)和神經(jīng)元的存活（圖4）。
 

圖4、GPR3參與小鼠原代培養(yǎng)RGCs的神經(jīng)突起生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活

作者認(rèn)為GPR3基因轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜聯(lián)合酵母聚糖治療可顯著刺激軸突再生，類似于cAMP聯(lián)合酵母聚糖治療后觀察到的情況。cAMP升高對(duì)生長(zhǎng)因子有增敏作用，并影響PKA-、ERK-和pi3k依賴的信號(hào)通路。因此，本研究觀察到GPR3對(duì)酵母聚糖的增敏作用可能是通過(guò)GPR3下游信號(hào)通路介導(dǎo)的。同時(shí)，Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)軸突再生具有多種影響，下調(diào)SOCS3或PTEN抑制劑可激活PI3K-Akt信號(hào)通路，從而增強(qiáng)ONC后的軸突再生。此外，軸突退變受Akt信號(hào)的調(diào)控，Akt信號(hào)的增強(qiáng)可以抵消多巴胺能軸突的逆行退變。同時(shí)CaMKII-CREB信號(hào)通路對(duì)于ONC后神經(jīng)元存活和軸突再生很重要。因此，損傷后RGCs軸突再生涉及多條信號(hào)通路，有趣的是，當(dāng)GPR3在CGNs中表達(dá)時(shí)，它可能激活多個(gè)下游信號(hào)通路。因此，GPR3激活與軸突再生相關(guān)的多條信號(hào)通路是視網(wǎng)膜軸突再生的可行機(jī)制。此外，GPR3可以在不添加配體的情況下維持cAMP的基礎(chǔ)水平。在目前的研究中，在ONC后4周，GPR3轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的軸突再生比 cAMP聯(lián)合酵母聚糖治療的細(xì)胞少。然而，GPR3對(duì)ONC后4周以上軸突再生的長(zhǎng)期影響尚不清楚。
 

NEPA 21（NEPA GENE）電轉(zhuǎn)染儀在本研究中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，作者通過(guò)CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng)并使用NEPA 21電轉(zhuǎn)染儀獲得了PA-GPR3敲入小鼠，采用純合子PA-GPR3轉(zhuǎn)基因小鼠，用抗PA抗體進(jìn)行視網(wǎng)膜中GPR3表達(dá)的免疫染色分析，從而確定了GPR3在視網(wǎng)膜中的分布及表達(dá)情況。為了包裝AAV, PAAV質(zhì)粒、Rep2-Cap2質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒使用NEPA 21電轉(zhuǎn)染儀共轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，獲取到AAV載體，然后進(jìn)行濃縮和純化，為后續(xù)的確定軸突再生實(shí)驗(yàn)提供了良好的病毒載體。 
 

NEPA 21 高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)
 

艾貝泰生物科技有限公司細(xì)胞醫(yī)學(xué)部根據(jù)細(xì)胞存儲(chǔ)、細(xì)胞治療技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用研究等不同領(lǐng)域的特點(diǎn)，推出針對(duì)性應(yīng)用技術(shù)的細(xì)胞治療平臺(tái)產(chǎn)品鏈。

 

說(shuō)明

原文鏈接：

https://doi. org/10.1016/j.nbd.2022.105811.

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