細胞凍存與細胞復(fù)蘇，是細胞培養(yǎng)過程中的常見工作。細胞凍存，是指將細胞貯存在超低溫環(huán)境中，使細胞暫時“冬眠”的技術(shù)，在需要的時候再進行復(fù)蘇。細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。細胞復(fù)蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍重新培養(yǎng)，細胞恢復(fù)生長的過程。那么為什么復(fù)蘇細胞要慢速冷凍快速復(fù)蘇呢?

細胞慢凍快融原則

除了凍存保護劑之外，冷凍和升溫的速度也直接影響細胞的存活率。做過細胞凍存復(fù)蘇的人都可能聽說過“慢凍快融”的原則。這樣可以最大限度的保存細胞活力。如今細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

慢凍是為了減少細胞內(nèi)的水分，從而降低水分結(jié)冰導(dǎo)致的傷害。為了說清這個道理，需要一點點物理學(xué)知識。我們知道，水溶液結(jié)冰是一個溶質(zhì)溶劑相互作用的過程。溶液的濃度越高，開始結(jié)冰的溫度（冰點）就越低。溶液結(jié)冰時，作為溶劑的水優(yōu)先結(jié)冰，同時把溶質(zhì)外排，這樣就導(dǎo)致溶質(zhì)的濃度越來越高。溶質(zhì)的濃度越高，則剩下的溶液要進一步結(jié)冰，需要的溫度就更低，直到一個最終完全結(jié)冰的溫度（共熔點）。也就是說，水溶液的結(jié)冰是一個溫度逐漸降低（從冰點最后降低到共熔點）、溶液濃度逐漸升高的過程。

但是這樣的結(jié)冰過程也是有條件的，那就是外界的溫度不能急劇降低，讓溶劑結(jié)冰的時候，有足夠的時間把溶質(zhì)排除到冰體之外。否則，溫度降低太快，溶質(zhì)就會被困在溶劑中間一同凝固，這在物理學(xué)上叫玻璃化凝固，而非真正的結(jié)冰。慢凍就是為了讓凍存液真正結(jié)冰，結(jié)冰的過程中，凍存液的濃度會逐漸提高，滲透壓也逐漸提高，細胞內(nèi)的水分就會逐漸滲透到細胞外，從而減弱細胞內(nèi)水分結(jié)冰導(dǎo)致的傷害。

理論和實踐表明，細胞冷凍的速度控制在每分鐘降低1°C效果好。

那么快融又是什么道理呢？快融是為了防止融解過程中的局部區(qū)域發(fā)生反復(fù)凍融。

細胞凍存介紹

凍存原則

細胞凍存原則為“慢凍”，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。

如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細胞會受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。

細胞凍存密度

細胞凍存和復(fù)蘇過程中，不可避免會損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細胞復(fù)蘇存活率，推薦密度為100~300萬細胞/mL。

細胞凍存步驟

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例

a.收集細胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

細胞復(fù)蘇介紹

細胞復(fù)蘇講究“快融”，越快融化，細胞所受損傷就越小。細胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率。

細胞復(fù)蘇步驟

1.凍存細胞從液氮中取出后,立即放入37°C水浴中，輕輕搖動冷凍管,使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘），加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。

2.在1000 rpm條件下離心5 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻

3.將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤? cm皿中，加入約4mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。

4.第二天換液并檢查細胞密度。

如何判斷細胞復(fù)蘇成功與否

判斷細胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細胞，用臺盼藍染色法檢測復(fù)蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細胞，得出細胞存活率）。如果復(fù)蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細胞恢復(fù)到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數(shù)量。

需要注意的是，復(fù)蘇的細胞需要一段時間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇后的細胞密度低于80%時，48小時內(nèi)不要換液，待細胞形態(tài)、生長速度等恢復(fù)正常，再進行細胞傳代等操作，不要因為復(fù)蘇后兩三天細胞狀態(tài)不好就丟棄，應(yīng)耐心等待至少一周。