引言：神經(jīng)元發(fā)育研究為什么要關(guān)注線粒體？

神經(jīng)元（神經(jīng)元細(xì)胞），是神經(jīng)系統(tǒng)基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，神經(jīng)元之間形成復(fù)雜而準(zhǔn)確的網(wǎng)絡(luò)連接，從維持正常生命活動(dòng)所需的心跳、呼吸，到實(shí)現(xiàn)基本活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、感覺(jué)傳遞，再到高等思維方式如學(xué)習(xí)、記憶，都依賴于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元正常的形態(tài)發(fā)育對(duì)于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成至關(guān)重要。神經(jīng)元發(fā)育需要持續(xù)的能量供應(yīng)。線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的能量工廠，是幾乎所有真核生物都存在的一種細(xì)胞器。它的主要功能是進(jìn)行氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP，是糖類、脂肪和氨基酸等物質(zhì)的最終氧化釋放能量的場(chǎng)所，對(duì)維持生物體正常生理功能至關(guān)重要；線粒體除了作為細(xì)胞內(nèi)能量生成的關(guān)鍵細(xì)胞器，還參與細(xì)胞凋亡、自由基產(chǎn)生、脂質(zhì)代謝等代謝過(guò)程。神經(jīng)元發(fā)育嚴(yán)重依賴線粒體，由于其復(fù)雜的形態(tài)和高能量代謝要求，容易受到線粒體功能障礙的影響。神經(jīng)元發(fā)育與線粒體功能密切相關(guān)，但關(guān)于神經(jīng)元發(fā)育能量代謝的調(diào)控機(jī)制，尤其是神經(jīng)元發(fā)育與線粒體氧化磷酸化如何協(xié)同調(diào)控，目前仍不甚清楚。

線粒體氧化磷酸化功能評(píng)估為神經(jīng)元發(fā)育研究帶來(lái)的重要參考

線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)系統(tǒng)是線粒體能量代謝的中心，是真核細(xì)胞能量產(chǎn)生的關(guān)鍵。支持OXPHOS系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的是電子傳遞鏈 (ETC)的上五種酶復(fù)合體:復(fù)合體I、復(fù)合體lI、復(fù)合體III和復(fù)合體IV，由復(fù)合體I、lI、III、IV生成的質(zhì)子梯度隨后被復(fù)合體V所利用，催化ADP磷酸化生成ATP。OXPHOS系統(tǒng)中任何一個(gè)復(fù)合體發(fā)生異常或功能障礙，都會(huì)容易導(dǎo)致線粒體發(fā)生功能障礙，因此通過(guò)檢測(cè)OXPHOS系統(tǒng)各復(fù)合體功能活性來(lái)評(píng)估線粒體氧化磷酸化功能，將為深入研究線粒體在神經(jīng)元發(fā)育研究中的分子作用機(jī)制帶來(lái)重要參考。但如何快速檢測(cè)分析OXPHOS各復(fù)合體的功能活性，是評(píng)估線粒體氧化磷酸化功能活性的技術(shù)難點(diǎn)。目前對(duì)OXPHOS各復(fù)合體的功能活性的檢測(cè)，主要是采用比色法，操作時(shí)間長(zhǎng)，步驟多，只能對(duì)單個(gè)復(fù)合體功能活性進(jìn)行終點(diǎn)法的檢測(cè)分析，無(wú)法一次性實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)分析同一樣本各復(fù)合體功能活性。

奧地利Oroboros技術(shù)特點(diǎn)：一次性同時(shí)快速檢測(cè)線粒體氧化磷酸化各復(fù)合體的功能活性

Oroboros O2k提供了一種獨(dú)特的SUIT（底物-解偶聯(lián)劑-抑制劑-滴定，Substrate-uncoupler-inhibitor-titration）檢測(cè)方案來(lái)檢測(cè)線粒體氧化磷酸化各復(fù)合體的功能活性。Oroboros O2k沒(méi)有加藥孔的限制，也沒(méi)有試劑盒的限制，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活的無(wú)限制的添加底物、抑制劑、解偶聯(lián)劑及不同濃度的藥物滴定，實(shí)現(xiàn)同一個(gè)樣本一次性快速進(jìn)行復(fù)合體I、復(fù)合體II、復(fù)合體IV、 zui 大呼吸率、ATP合酶的功能活性檢測(cè)，深度挖掘線粒體能量代謝信息，快速評(píng)估和表征線粒體氧化磷酸化各復(fù)合體功能活性，從而助力神經(jīng)元發(fā)育研究。

應(yīng)用案例：2023年開(kāi)年《Science》|線粒體代謝決定神經(jīng)元發(fā)育的特種特異性速度

研究摘要：與其他哺乳動(dòng)物相比，人類大腦皮層的神經(jīng)元發(fā)育顯著延長(zhǎng)。這一發(fā)育以及成熟過(guò)程的延長(zhǎng)可能正是人腦功能增強(qiáng)的基礎(chǔ)。那么線粒體能量代謝過(guò)程是否影響到不同物種中皮層神經(jīng)元的成熟呢?為了揭開(kāi)這一問(wèn)題的答案，2023年1月比利時(shí)VIB大腦與疾病研究中心Pierre Vanderhaeghen教授在《Science》發(fā)表了題為《Mitochondria metabolism sets the species- specific tempo of neuronal development》的研究論文，通過(guò)對(duì)人類和小鼠皮層神經(jīng)元的比較，發(fā)現(xiàn)人類皮層神經(jīng)元中線粒體發(fā)育較慢、代謝活性較低，尤其是氧化磷酸化，刺激人類神經(jīng)元中線粒體代謝可以加速神經(jīng)元的發(fā)育，導(dǎo)致神經(jīng)元提前數(shù)周成熟，而在小鼠神經(jīng)元中抑制線粒體代謝則導(dǎo)致成熟率降低。Pierre Vanderhaeghen教授在2023年開(kāi)年發(fā)表在《Science》的研究論文為理解線粒體代謝與不同物種神經(jīng)元成熟過(guò)程提供了新的見(jiàn)解。

研究結(jié)果：

（1）作者通過(guò)一種神經(jīng)元出生日期測(cè)定系統(tǒng)（NeuroD1依賴性新生神經(jīng)元（NNN）標(biāo)記），并且與線粒體標(biāo)記相結(jié)合，觀察發(fā)現(xiàn)，與小鼠相比，人皮層神經(jīng)元的線粒體發(fā)育較慢，皮層神經(jīng)元成熟過(guò)程中的線粒體發(fā)育遵循物種特定的時(shí)間線。

（2）作者通過(guò)奧地利Oroboros O2k檢測(cè)了神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中線粒體的功能特性，重點(diǎn)是評(píng)估線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和電子傳遞鏈（ETC）能力（圖2，A至C）。O2k測(cè)定發(fā)現(xiàn)，從早期階段開(kāi)始，小鼠的線粒體OCR高于人類神經(jīng)元，并且增加得更快；分化2周后，小鼠的受刺激的OCR比人類受刺激的OCR高10倍以上。

（3）作者為了進(jìn)一步探究了神經(jīng)元線粒體代謝活性對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的影響。設(shè)計(jì)了不同的實(shí)驗(yàn)方案：用LDHA【乳酸脫氫酶（LDH），LDHA有利于丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸】化學(xué)抑制劑GSK-2837808A（稱為GSK）進(jìn)行處理；以及將神經(jīng)元細(xì)胞暴露于游離脂肪酸（FFA）（AlbuMAX）；

（4、5）作者再次通過(guò)奧地利Oroboros O2k檢測(cè)了GSK和AlbuMAX不同組合實(shí)驗(yàn)方案刺激神經(jīng)元后的線粒體代謝活性；發(fā)現(xiàn)增加線粒體OCR，尤其是氧化磷酸化（OXPHOS）和電子傳遞鏈（ETC）中復(fù)合體I（CI）和復(fù)合體IV（CIV）能力，加速人類神經(jīng)元的形態(tài)分化。

參考文獻(xiàn)：Iwata R, et al., Mitochondria metabolism sets the species-specific tempo of neuronal development. Science. 2023 Feb 10;379(6632):eabn4705. doi: 10.1126/science.abn4705. Epub 2023 Feb 10. PMID: 36705539.