小鼠TLR家族對內(nèi)毒素的生物學(xué)作用介紹（一）
20 世紀(jì)60年代中期研究者就發(fā)現(xiàn)，C3H/HeJ小鼠品系對內(nèi)毒素具有天然耐受性，對G-菌具有易患性。1978年，LPS反應(yīng)基因被命名為Lps基因，強調(diào)了其在內(nèi)毒素致病方面的重要性，并確定Lps基因在位于4號染色體上Mup-1和Ps基因座之間。1997年，Poltorak 等將Lps基因縮小到兩個新的微衛(wèi)星標(biāo)記點B和83.3之間， DNA跨度為3.2Mb長度。1999年，Qureshi等將Lps 基因縮小到0.9厘摩爾根間隔區(qū)內(nèi)，跨度為1.7Mb。隨后研究已經(jīng)鑒定Lps 基因編碼三個轉(zhuǎn)錄單位，其中包括TLR4[LPS的生理作用是通過存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的Toll樣受體（Toll-like Receptor、TRL）4（TRL4）而體現(xiàn)的]。
在C3H/HeJ和C57BL/ScCr小鼠，Tlr4基因均存在突變，在C3H/HeJ品系中TLR4 DNA中2342位C被A所取代，結(jié)果其編碼的712位氨基酸鏈由脯氨酸取代組氨酸，使其胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在內(nèi)毒素刺激時突變的TLR4受體也發(fā)生受體二聚化及內(nèi)化反應(yīng)，但P712H的變異體已破壞其全蛋白（holoprotein）的功能，不能誘導(dǎo)酶學(xué)級聯(lián)反應(yīng)及激活細(xì)胞因子表達(dá)，表現(xiàn)為內(nèi)毒素耐受；C3H/HeJ小鼠的Tlr4Lps-d與C3H/HeN小鼠的Tlr4Lps-d為等位基因，呈共顯性（co-dominant）表達(dá)，F(xiàn)1代小鼠雜合子對內(nèi)毒素反應(yīng)表現(xiàn)為中度敏感，證實了TLR4參與內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。通過對C3H/HeJ和C3H/HeN同源系小鼠的研究，否認(rèn)了既往認(rèn)為LPS是通過插入宿主細(xì)胞膜上誘發(fā)宿主細(xì)胞膜的通透性升高的這一致病假說。
另外，C57BL/ScCr 為Tlr4基因區(qū)DNA片段發(fā)生缺失，因不表達(dá)TLR4受體，故表現(xiàn)為內(nèi)毒素耐受。
TLR4在膜上表達(dá)量較低，每個單核-巨噬細(xì)胞約有1000個TLR4分子，而每個中性粒細(xì)胞的細(xì)胞膜上有7000個CD14受體分子，每個單核-巨噬細(xì)胞中CD14超過4.0×104~4.5×104個，如受體達(dá)2.79×104個，CD14可以濃集內(nèi)毒素分子作用，加速內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給TLR并引起內(nèi)毒素內(nèi)化反應(yīng)。
研究表明，TLR4對LPS反應(yīng)非常重要。Lps基因突變能夠阻止大腸菌屬如鼠傷寒桿菌、大腸桿菌LPS所誘發(fā)的反應(yīng)。Lps基因突變的B細(xì)胞不能對LPS發(fā)生增殖反應(yīng)。Lps基因突變影響最顯著的是巨噬細(xì)胞，突變的巨噬細(xì)胞被內(nèi)毒素攻擊時細(xì)胞因子分泌顯著降低，不能吞噬經(jīng)過調(diào)理的顆粒，不能產(chǎn)生反應(yīng)性氧和NO，巨噬細(xì)胞內(nèi)化反應(yīng)缺損。
LPS主要通過CD14依賴性巨胞飲途徑（macropinocytic pathway）以聚集體發(fā)生內(nèi)化（internalization）進入內(nèi)體（endosome）細(xì)胞器后，再轉(zhuǎn)移到溶酶體內(nèi)，由�；然饷福╝cyloxyacyl hydrolase）水解脂肪鏈，形成脫�；|(zhì)A，然后脂質(zhì)A可以進一步在磷酸酶作用下去磷酸化，水解1位磷酸基形成單磷酸基脂質(zhì)ⅣA。部分學(xué)者認(rèn)為LPS單體需要內(nèi)化到高爾基體才可以發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，引發(fā)激活效應(yīng)，這種觀點未得到一致認(rèn)可。Tlr4 基因突變小鼠有內(nèi)化功能障礙，不能及時清除內(nèi)毒素分子，所以對內(nèi)毒素反應(yīng)減弱，但易發(fā)生反復(fù)革蘭陰性桿菌感染，而對革蘭陽性桿菌反應(yīng)正常，后者可能由TLR2進行識別。
另外，在高濃度LPS情況下，即使Tlr4基因突變也可誘發(fā)細(xì)胞因子表達(dá)；牙齦葉啉單胞菌的LPS 也能誘發(fā)正常的生物學(xué)效應(yīng)，與TIr4基因突變無關(guān)，說明有其他蛋白取代了TLR4的功能。Ran也在Lps基因范圍內(nèi)，其在上述兩種低內(nèi)毒素反應(yīng)的小鼠品系中均存在突變。運用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將野生型Ran基因轉(zhuǎn)染給Ran基因缺陷的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)，可以恢復(fù)其對內(nèi)毒素的反應(yīng)，轉(zhuǎn)染缺陷的Ran可以使巨噬細(xì)胞對LPS產(chǎn)生耐受。Ran具有多種生物學(xué)功能，如參與核物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分裂、紡錘體的形成等，所以 Ran可能參與內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)中的某個環(huán)節(jié)。至于Ran與TLR的關(guān)系有待進一步研究。
另外，LPS也可以通過膜組織性外突蛋白（簡稱膜外突蛋白）發(fā)生生物學(xué)作用，并可作為CD14的協(xié)同受體，介導(dǎo)內(nèi)毒素的反應(yīng)，其作用類似于TLR。用抗膜外突蛋白抗體可完全阻止內(nèi)毒素的反應(yīng)。膜外突蛋白和TLR4之間的關(guān)系還有待闡明。
在C3H/HeJ和C57BL/ScCr小鼠，Tlr4基因均存在突變，在C3H/HeJ品系中TLR4 DNA中2342位C被A所取代，結(jié)果其編碼的712位氨基酸鏈由脯氨酸取代組氨酸，使其胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在內(nèi)毒素刺激時突變的TLR4受體也發(fā)生受體二聚化及內(nèi)化反應(yīng)，但P712H的變異體已破壞其全蛋白（holoprotein）的功能，不能誘導(dǎo)酶學(xué)級聯(lián)反應(yīng)及激活細(xì)胞因子表達(dá)，表現(xiàn)為內(nèi)毒素耐受；C3H/HeJ小鼠的Tlr4Lps-d與C3H/HeN小鼠的Tlr4Lps-d為等位基因，呈共顯性（co-dominant）表達(dá)，F(xiàn)1代小鼠雜合子對內(nèi)毒素反應(yīng)表現(xiàn)為中度敏感，證實了TLR4參與內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。通過對C3H/HeJ和C3H/HeN同源系小鼠的研究，否認(rèn)了既往認(rèn)為LPS是通過插入宿主細(xì)胞膜上誘發(fā)宿主細(xì)胞膜的通透性升高的這一致病假說。
另外，C57BL/ScCr 為Tlr4基因區(qū)DNA片段發(fā)生缺失，因不表達(dá)TLR4受體，故表現(xiàn)為內(nèi)毒素耐受。
TLR4在膜上表達(dá)量較低，每個單核-巨噬細(xì)胞約有1000個TLR4分子，而每個中性粒細(xì)胞的細(xì)胞膜上有7000個CD14受體分子，每個單核-巨噬細(xì)胞中CD14超過4.0×104~4.5×104個，如受體達(dá)2.79×104個，CD14可以濃集內(nèi)毒素分子作用，加速內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給TLR并引起內(nèi)毒素內(nèi)化反應(yīng)。
研究表明，TLR4對LPS反應(yīng)非常重要。Lps基因突變能夠阻止大腸菌屬如鼠傷寒桿菌、大腸桿菌LPS所誘發(fā)的反應(yīng)。Lps基因突變的B細(xì)胞不能對LPS發(fā)生增殖反應(yīng)。Lps基因突變影響最顯著的是巨噬細(xì)胞，突變的巨噬細(xì)胞被內(nèi)毒素攻擊時細(xì)胞因子分泌顯著降低，不能吞噬經(jīng)過調(diào)理的顆粒，不能產(chǎn)生反應(yīng)性氧和NO，巨噬細(xì)胞內(nèi)化反應(yīng)缺損。
LPS主要通過CD14依賴性巨胞飲途徑（macropinocytic pathway）以聚集體發(fā)生內(nèi)化（internalization）進入內(nèi)體（endosome）細(xì)胞器后，再轉(zhuǎn)移到溶酶體內(nèi)，由�；然饷福╝cyloxyacyl hydrolase）水解脂肪鏈，形成脫�；|(zhì)A，然后脂質(zhì)A可以進一步在磷酸酶作用下去磷酸化，水解1位磷酸基形成單磷酸基脂質(zhì)ⅣA。部分學(xué)者認(rèn)為LPS單體需要內(nèi)化到高爾基體才可以發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，引發(fā)激活效應(yīng)，這種觀點未得到一致認(rèn)可。Tlr4 基因突變小鼠有內(nèi)化功能障礙，不能及時清除內(nèi)毒素分子，所以對內(nèi)毒素反應(yīng)減弱，但易發(fā)生反復(fù)革蘭陰性桿菌感染，而對革蘭陽性桿菌反應(yīng)正常，后者可能由TLR2進行識別。
另外，在高濃度LPS情況下，即使Tlr4基因突變也可誘發(fā)細(xì)胞因子表達(dá)；牙齦葉啉單胞菌的LPS 也能誘發(fā)正常的生物學(xué)效應(yīng)，與TIr4基因突變無關(guān)，說明有其他蛋白取代了TLR4的功能。Ran也在Lps基因范圍內(nèi)，其在上述兩種低內(nèi)毒素反應(yīng)的小鼠品系中均存在突變。運用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將野生型Ran基因轉(zhuǎn)染給Ran基因缺陷的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)，可以恢復(fù)其對內(nèi)毒素的反應(yīng)，轉(zhuǎn)染缺陷的Ran可以使巨噬細(xì)胞對LPS產(chǎn)生耐受。Ran具有多種生物學(xué)功能，如參與核物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分裂、紡錘體的形成等，所以 Ran可能參與內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)中的某個環(huán)節(jié)。至于Ran與TLR的關(guān)系有待進一步研究。
另外，LPS也可以通過膜組織性外突蛋白（簡稱膜外突蛋白）發(fā)生生物學(xué)作用，并可作為CD14的協(xié)同受體，介導(dǎo)內(nèi)毒素的反應(yīng)，其作用類似于TLR。用抗膜外突蛋白抗體可完全阻止內(nèi)毒素的反應(yīng)。膜外突蛋白和TLR4之間的關(guān)系還有待闡明。
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