自新冠mRNA疫苗成功上市以來(lái)，脂質(zhì)納米粒（Lipid nanoparticle，LNP）已成為mRNA、siRNA、pDNA等核酸的優(yōu)先遞送載體，廣泛用于mRNA疫苗及治療。微流控技術(shù)是目前制備核酸脂質(zhì)納米粒常用的技術(shù)，包封率則是評(píng)價(jià)其制備效果的重要指標(biāo)之一，下面就為大家介紹使用RiboGreen測(cè)定RNA-LNP包封率的方法。

 

1 RiboGreen檢測(cè)RNA-LNP包封率的原理

1.1RNA-LNP包封率（Encapsulationefficiency，EE）：包裹在脂質(zhì)納米粒內(nèi)部的RNA占RNA-LNP溶液中全部RNA的比例。

 

1.2 RiboGreen檢測(cè)RNA原理：RiboGreen是一種用于定量檢測(cè)溶液中RNA含量的超敏感熒光核酸染料，當(dāng)RiboGreen熒光染料處于溶液狀態(tài)時(shí)，幾乎沒(méi)有熒光活性，與RNA結(jié)合時(shí)，其熒光活性將增加1000倍。RiboGreen-RNA復(fù)合物的熒光激發(fā)波長(zhǎng)約500nm，發(fā)射波長(zhǎng)約525nm，通過(guò)酶標(biāo)儀，建立已知濃度RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到樣品RNA濃度。

 

1.3 RiboGreen檢測(cè)包封率原理：分別測(cè)定LNP-RNA溶液中游離RNA濃度，以及用Triton-100破壞LNP結(jié)構(gòu)后，溶液中全部的RNA濃度，兩者的差值就是包封在LNP內(nèi)部的RNA濃度。通過(guò)以下公式即可計(jì)算得到包封率結(jié)果。

圖1核酸脂質(zhì)納米顆粒的示意圖
 

2操作要點(diǎn)

2.1制備Buffer

1X TE Buffer：使用試劑盒中20X TE Buffer稀釋。

2% Triton-TE buffer：使用Triton-100與1X TE buffer以體積比1：50配制。

 

2.2添加RNA-LNP樣品至全黑96孔板

根據(jù)制備時(shí)RNA的量，可以大致計(jì)算需要稀釋的倍數(shù)。例如，已知 mRNA的原始質(zhì)量或濃度，使用銘汰MicroFlow S進(jìn)行RNA-LNP合成，根據(jù)稀釋、超濾等處理后的最終體積，即可估算大致總RNA濃度。同時(shí)，假設(shè)90%的包封率，即可估算游離RNA濃度。然后根據(jù)標(biāo)曲的最高濃度計(jì)算需要稀釋的大致倍數(shù)。

這樣我們就可以使用1X TE buffer將RNA-LNP稀釋適合倍數(shù)以檢測(cè)LNP外游離RNA濃度，使用2% Triton-TE buffer將RNA-LNP稀釋適合倍數(shù)以檢測(cè)總RNA濃度，建議每項(xiàng)檢測(cè)至少兩個(gè)不同稀釋倍數(shù)。

最后，分別移取100 μL稀釋后的樣本，添加到全黑96孔板。

 

2.3標(biāo)樣添加

一般直接使用試劑盒中100 μg/mL的RNA標(biāo)樣，也可以使用與待測(cè)樣本類似的RNA標(biāo)樣來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線�？梢韵扔�1X TE buffer將原始標(biāo)樣稀釋到工作濃度4 μg/mL，然后參考表1的體積比，配制為一定濃度梯度的標(biāo)樣。分別移取各濃度的標(biāo)樣100 μL，添加到全黑96孔板中。

注：*最終RNA濃度考慮了步驟2.4添加RiboGreen染料后的濃度
 

當(dāng)RNA-LNP樣品及特定濃度的標(biāo)樣添加到96孔板后，需要在37℃下避光孵育10 min，以使RNA-LNP在Triton buffer中充分裂解。

2.4 RiboGreen染料添加

把試劑盒中RiboGreen試劑，使用1X TE Buffer按照1：100的比例稀釋，例如需要2000 μL RiboGreen染料，可將20 μL的RiboGreen試劑添加到1980 μL的1X TE Buffer中。然后各取100 μL加入到已經(jīng)加有樣品的96孔板中，37℃下避光孵育5min。

圖2 樣品添加
 

2.5酶標(biāo)儀檢測(cè)

打開酶標(biāo)儀，選擇熒光模式，激發(fā)光485nm，發(fā)射光528nm，讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

 

2.6數(shù)據(jù)處理及分析

    將每個(gè)樣本測(cè)得的熒光值減去空白熒光值，即可得到實(shí)際熒光值。根據(jù)標(biāo)樣的熒光值和濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。把樣品熒光值代入回歸方程，乘以稀釋倍數(shù)，即可得到樣本的RNA濃度。根據(jù)1.3中包封率公式計(jì)算得到包封率結(jié)果。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 小結(jié)

準(zhǔn)確的包封率測(cè)定對(duì)于評(píng)價(jià)RNA-LNP的包封效果至關(guān)重要，影響著后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展。RNA-LNP包封率測(cè)定一般使用商業(yè)化的試劑盒，雖然操作環(huán)節(jié)較多，但只要細(xì)心規(guī)范，操作起來(lái)也并不難，相信大家可以得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

納米藥物制備系統(tǒng)

 

應(yīng)用范圍：