磁珠的DNA純化自動化解決方案操作流程詳解
使用基于磁珠的DNA純化已成為NGS文庫制備的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管這是一種快速簡便的方法，但高通量測序成本的降低和單細(xì)胞測序的普及使待處理的樣本大大地增加。C.WASH兼容磁性板載體，采用獨(dú)特的非接觸式注液和反向離心移除液體的方式，支持在96和384微孔板中自動完成基于磁珠的DNA純化這一工作流程。
圖1. C.WASH非接觸式微孔板樣品處理系統(tǒng)
C.WASH的這些功能有助于簡化和標(biāo)準(zhǔn)化磁珠清洗，加快NGS文庫制備工作流程，并確保在液體移除或試劑分配過程中不會發(fā)生孔間交叉污染。
案例一：使用C.WASH進(jìn)行DNA自動純化樣品交叉污染的可能性
在此實(shí)驗(yàn)中，我們利用哺乳動物基因組DNA中占很大比例的串聯(lián)重復(fù)序列對C.WASH進(jìn)行評估，因?yàn)橹饕l(wèi)星重復(fù)序列（MSRs）由234個堿基對（bp）單體的重復(fù)序列組成，這些單體在著絲粒周圍區(qū)域富集并參與異染色質(zhì)的形成。它們在基因組中的豐度以及相對較小的長度使MSR成為定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）中檢測交叉污染的理想指標(biāo)。
圖2為使用C.WASH純化的工作流程：
1. 使用C.WASH移除上清液（離心力10g）
2. 使用C.WASH加入70%乙醇（20µL），等待30s
3. 使用C.WASH移除70%乙醇（離心力10g）
4. 使用C.WASH重復(fù)乙醇洗滌（步驟2和3）
5. 在室溫下放置樣品2min
6. 使用C.WASH加入20µL 超純水，孵育2min以重新水合
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
案例二：scRNA-seq文庫制備中的DNA純化
將HEK293FT(人類)和NIH3T3(小鼠)細(xì)胞經(jīng)FACS分選后，交替鋪到384孔板上，中間一行(H)作為陰性對照，如圖4所示。經(jīng)Smart-seq3儀器合成和擴(kuò)增cDNA后，分別使用C.WASH和另外一種液體處理儀器BRAVO對磁珠進(jìn)行清洗，并對比清洗效果。
表1. BRAVO和C.WASH的磁珠清洗流程對比
圖4. C.WASH和BRAVO實(shí)現(xiàn)文庫的可視化
圖5. 使用C.WASH和BRAVO清洗后相應(yīng)基因組的讀取數(shù)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
案例三：采用C.WASH純化PCR產(chǎn)物的DNA
SMART-seq2文庫制備后，分別對未純化的cDNA進(jìn)行手工清洗和使用C.WASH清洗，然后通過生物分析儀檢測對比結(jié)果。
圖6. 手工清洗和C.WASH清洗DNA純化中的磁珠工作流程示意圖
圖7. 手工清洗和C.WASH清洗結(jié)果對比圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 非接觸式清洗
通過非接觸式注液和孔板清洗，避免交叉污染。
2. 支持多種微孔板尺寸
能夠溫和地從任何SBS格式的96、384、1536孔板中去除液體。
3. 低殘余量
殘留體積小于0.1µl，高效洗滌效率減少了所需的洗滌循環(huán)次數(shù)。
4. DNA純化
由于采用了磁性板載體，NGS文庫的制備速度更快。
5. 快速、自動化
自動化和獨(dú)立的操作使其可以在1分鐘內(nèi)在96或384孔板中完成1次洗滌循環(huán)。
C. WASH不僅可以應(yīng)用于基于磁珠的DNA純化，其創(chuàng)新的清洗方式，還可以在其他領(lǐng)域發(fā)揮出重要作用：
1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
C.WASH自動化完成典型篩選工作流程中的所有清洗和分配步驟，已成為HTS環(huán)境中藥物發(fā)現(xiàn)或基因編輯的重要設(shè)備。
2. 免疫測定
ELISA是非常敏感的免疫測定，因此交叉污染和/或移液不準(zhǔn)確可能導(dǎo)致高變異系數(shù)（CV）。C.WASH精確的非接觸式分液避免了交叉污染，因此降低了CV。此外，洗滌后的較低殘留體積可提高洗滌效率，并減少所需的洗滌次數(shù)。
3. 懸浮細(xì)胞
可以使用C.WASH作為一種簡單且可重復(fù)的方法來清洗懸浮細(xì)胞。在將平板離心獲得細(xì)胞沉淀后，使用C.WASH排空液體上清液，與手動工作流程相比，洗滌液的殘余體積持續(xù)較低，細(xì)胞回收率更大。
4. 平板圖層
用蛋白質(zhì)或多肽包被的孔板可以提高細(xì)胞對微孔板的吸附能力。使用C.WASH向孔板內(nèi)注入涂層溶液，選擇培養(yǎng)時間，清洗和干燥板，以獲得合適的涂層，可以簡化實(shí)驗(yàn)室中的涂層過程。
C.WASH是一種非接觸式微孔板樣品處理系統(tǒng)，其反向離心技術(shù)可以快速且可重復(fù)地去除96、384和1536孔板上殘留量非常低的液體，此時特制的磁吸支架將磁珠吸附在孔底，以達(dá)到清洗和收集磁珠的目的。同時非接觸式注液技術(shù)能夠快速均勻地添加乙醇等試劑，避免了孔間的交叉污染。
圖1. C.WASH非接觸式微孔板樣品處理系統(tǒng)
C.WASH的這些功能有助于簡化和標(biāo)準(zhǔn)化磁珠清洗，加快NGS文庫制備工作流程，并確保在液體移除或試劑分配過程中不會發(fā)生孔間交叉污染。
一、C.WASH的評估及案例展示
案例一：使用C.WASH進(jìn)行DNA自動純化樣品交叉污染的可能性
在此實(shí)驗(yàn)中，我們利用哺乳動物基因組DNA中占很大比例的串聯(lián)重復(fù)序列對C.WASH進(jìn)行評估，因?yàn)橹饕l(wèi)星重復(fù)序列（MSRs）由234個堿基對（bp）單體的重復(fù)序列組成，這些單體在著絲粒周圍區(qū)域富集并參與異染色質(zhì)的形成。它們在基因組中的豐度以及相對較小的長度使MSR成為定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）中檢測交叉污染的理想指標(biāo)。
圖2為使用C.WASH純化的工作流程：
1. 使用C.WASH移除上清液（離心力10g）
2. 使用C.WASH加入70%乙醇（20µL），等待30s
3. 使用C.WASH移除70%乙醇（離心力10g）
4. 使用C.WASH重復(fù)乙醇洗滌（步驟2和3）
5. 在室溫下放置樣品2min
6. 使用C.WASH加入20µL 超純水，孵育2min以重新水合
圖2.C.WASH在384孔板中自動DNA純化工作流程
圖3. C.WASH DNA純化工作流程沒有交叉污染
圖3. C.WASH DNA純化工作流程沒有交叉污染
A） 384孔板中純化方案的布局。前兩列是磁珠和細(xì)胞裂解物的混合物（+DNA）或磁珠和水的混合物（-DNA）。B） qPCR擴(kuò)增后獲得的每個孔的循環(huán)閾值。C） 表示在擴(kuò)增周期內(nèi)每個樣本的Rn值（normalized reporter value）擴(kuò)增曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
- C.WASH可防止微孔板上樣本間的交叉污染(圖3）。
- C.WASH兼容高通量384孔磁珠的清理。
- 與傳統(tǒng)的手動方法相比，C.WASH減少了磁珠的清理時間和成本。
案例二：scRNA-seq文庫制備中的DNA純化
將HEK293FT(人類)和NIH3T3(小鼠)細(xì)胞經(jīng)FACS分選后，交替鋪到384孔板上，中間一行(H)作為陰性對照，如圖4所示。經(jīng)Smart-seq3儀器合成和擴(kuò)增cDNA后，分別使用C.WASH和另外一種液體處理儀器BRAVO對磁珠進(jìn)行清洗，并對比清洗效果。
表1. BRAVO和C.WASH的磁珠清洗流程對比圖4. C.WASH和BRAVO實(shí)現(xiàn)文庫的可視化
圖5. 使用C.WASH和BRAVO清洗后相應(yīng)基因組的讀取數(shù)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
- C.WASH整個清洗過程只需要2分鐘的時間，相比BRAVO，C.WASH能更進(jìn)一步加快NGS文庫制備工作流程（表1）。
- C.WASH提供獨(dú)立的操作程序，可以與自動化的高通量工作流程無縫集成，提高每天需要處理的樣品和微孔板的數(shù)量（圖4）。
- 使用C.WASH所得到的結(jié)果顯示，它能夠避免交叉污染，從而有效地保護(hù)PCR擴(kuò)增的cDNA片段（圖5）。
案例三：采用C.WASH純化PCR產(chǎn)物的DNA
SMART-seq2文庫制備后，分別對未純化的cDNA進(jìn)行手工清洗和使用C.WASH清洗，然后通過生物分析儀檢測對比結(jié)果。
圖6. 手工清洗和C.WASH清洗DNA純化中的磁珠工作流程示意圖
圖7. 手工清洗和C.WASH清洗結(jié)果對比圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
- 手工清洗非常耗時，C.WASH將關(guān)鍵的步驟減少到僅5min，比傳統(tǒng)手動操作快5倍，同時不需要消耗槍頭（圖6）。
- 通過對比生物分析儀的結(jié)果，可以看到C.WASH與手工清洗相比，在DNA純化方面達(dá)到了相同的清洗效果，并且C.WASH清洗速度更快（圖7）。
- 非接觸式的分液方式，不僅節(jié)省了時間，還節(jié)省了槍頭，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
二、C.WASH系統(tǒng)優(yōu)勢
1. 非接觸式清洗
通過非接觸式注液和孔板清洗，避免交叉污染。
2. 支持多種微孔板尺寸
能夠溫和地從任何SBS格式的96、384、1536孔板中去除液體。
3. 低殘余量
殘留體積小于0.1µl，高效洗滌效率減少了所需的洗滌循環(huán)次數(shù)。
4. DNA純化
由于采用了磁性板載體，NGS文庫的制備速度更快。
5. 快速、自動化
自動化和獨(dú)立的操作使其可以在1分鐘內(nèi)在96或384孔板中完成1次洗滌循環(huán)。
三、C.WASH其他應(yīng)用領(lǐng)域
C. WASH不僅可以應(yīng)用于基于磁珠的DNA純化，其創(chuàng)新的清洗方式，還可以在其他領(lǐng)域發(fā)揮出重要作用：
1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
C.WASH自動化完成典型篩選工作流程中的所有清洗和分配步驟，已成為HTS環(huán)境中藥物發(fā)現(xiàn)或基因編輯的重要設(shè)備。
2. 免疫測定
ELISA是非常敏感的免疫測定，因此交叉污染和/或移液不準(zhǔn)確可能導(dǎo)致高變異系數(shù)（CV）。C.WASH精確的非接觸式分液避免了交叉污染，因此降低了CV。此外，洗滌后的較低殘留體積可提高洗滌效率，并減少所需的洗滌次數(shù)。
3. 懸浮細(xì)胞
可以使用C.WASH作為一種簡單且可重復(fù)的方法來清洗懸浮細(xì)胞。在將平板離心獲得細(xì)胞沉淀后，使用C.WASH排空液體上清液，與手動工作流程相比，洗滌液的殘余體積持續(xù)較低，細(xì)胞回收率更大。
4. 平板圖層
用蛋白質(zhì)或多肽包被的孔板可以提高細(xì)胞對微孔板的吸附能力。使用C.WASH向孔板內(nèi)注入涂層溶液，選擇培養(yǎng)時間，清洗和干燥板，以獲得合適的涂層，可以簡化實(shí)驗(yàn)室中的涂層過程。
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