PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?nbsp;掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)
二、PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合.
3. 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。
上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTPs、MgCl2、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
三、 試劑和緩沖液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
四、 儀器耗材
PCR儀，掌上離心機(jī)，微量移液器，槍頭，1.5mL離心管，PCR管，冰盒。
五、 實(shí)驗(yàn)步驟（每人一組，每人做1管，純化時(shí)兩人一組）
1. 查找基因序列，設(shè)計(jì)合成PCR引物。注意合成引物約需一周時(shí)間，請?zhí)崆皽?zhǔn)備。詳細(xì)步驟請參考實(shí)驗(yàn)一后面的附件內(nèi)容。
2. 在50μL反應(yīng)體系中，加入：
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2 (10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制，注意混勻后離心。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預(yù)變性94℃ 4min，然后循環(huán)：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃10min 。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR產(chǎn)物2-5μL與上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳，160V 30-40min。
6. 電泳結(jié)束，溴化乙錠染色5-10分鐘。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照。
8. PCR產(chǎn)物切膠回收。步驟參見膠回收Kit說明書。
A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。具體操作步驟如下，詳見說明書。
1）稱回收的膠，每0.1g加100µL XP2 ；
2）55度5-7分鐘至完全溶膠 ；
3）取溶膠液加入回收柱子，最大體積700µL；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加700µl SPW ，10000g 1min；
6）重復(fù)5）；
7）空管離心2min，13000 g
8）干燥，加15-30µL Eulation Buffer
9）13000 g，1min
DNA產(chǎn)物純化kit，操作步驟：
● 將PCR反應(yīng)液（40ul）或酶促反應(yīng)液移至一干凈的1.5ml離心管中，加入5倍體積的buffer3，充分混勻。（用前確定加入適量的異丙醇）
● 將混合液全部移入吸附柱，8000g離心30s；將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱，8000g離心30s（此步驟可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。
● 向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上），9000g離心30s。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。（Wash Solution首次使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇）
● 重復(fù)步驟3一次
● 將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，9000g離心1min。下管扔掉，上管放入1.5ml離心管中，晾干。（殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗(yàn)）
● 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預(yù)熱（進(jìn)一步提高得率）的Elution Buffer（加到濾芯上），室溫靜置1min，9000g離心1min。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。 注意：本步驟中，所有轉(zhuǎn)速單位為g。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對(duì)PCR產(chǎn)物回收。具體操作步驟如下。
● 加入等體積的冰無水乙醇，加入1/10體積的KAc（3M pH5.2）。
● 上下顛倒混勻，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。
● 棄上清，加入70%的冰乙醇，輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min。
● 棄上清，室溫干燥，至無乙醇。
● 加入適量體積的ddH2O。
六、注意事項(xiàng)
1. 進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，注意加入試劑的順序。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實(shí)驗(yàn)使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀釋：分子量24bp*324.5 = 7788，質(zhì)量數(shù)10OD*33 ＝33ug，摩爾數(shù)=33/7788 =4.2 nmol，母液濃度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L，使用時(shí)取母液稀釋5倍，則終濃度為10μmol/L。
4. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物共20μL，其中2-5 μL用于檢測，剩余的用于純化回收。
5. 使用自己的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增的學(xué)生，請?zhí)崆皽?zhǔn)備引物和模板。
附1：基因序列查找和PCR引物設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行之前，需要利用NCBI查找基因序列，并設(shè)計(jì)PCR引物。
● 進(jìn)入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）后，在Search的下拉框中選擇Nucleotide，再輸入基因名稱，點(diǎn)擊Search即可。也可輸入具體的物種名以縮小范圍，獲得cDNA 序列信息。 例如：水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（Oryzacystatin, OC）序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCG
TTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGA
TGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGG
CCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAAC
AGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGG
GCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTAC
GAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCC
TCGACGACGCCACCGCCTAA
● 引物設(shè)計(jì)。要求擴(kuò)增上述完整的cDNA 序列，并在兩端添加酶切位點(diǎn)，5‘添加EcoRI（GAATTC）， 3‘端添加HindIII （AAGCTT）。以便克隆到pET30a的相應(yīng)位點(diǎn)。 注意PCR產(chǎn)物中沒有上述酶切位點(diǎn)，否則不能使用。
prim-OC2-R GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC 26bp 下劃線為EcoRI識(shí)別序列
#prim-OC2-F GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC 26bp 下劃線為HindIII 識(shí)別序列
T載體通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
二、PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合.
3. 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。
上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTPs、MgCl2、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
三、 試劑和緩沖液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
四、 儀器耗材
PCR儀，掌上離心機(jī)，微量移液器，槍頭，1.5mL離心管，PCR管，冰盒。
五、 實(shí)驗(yàn)步驟（每人一組，每人做1管，純化時(shí)兩人一組）
1. 查找基因序列，設(shè)計(jì)合成PCR引物。注意合成引物約需一周時(shí)間，請?zhí)崆皽?zhǔn)備。詳細(xì)步驟請參考實(shí)驗(yàn)一后面的附件內(nèi)容。
2. 在50μL反應(yīng)體系中，加入：
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2 (10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制，注意混勻后離心。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預(yù)變性94℃ 4min，然后循環(huán)：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃10min 。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR產(chǎn)物2-5μL與上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳，160V 30-40min。
6. 電泳結(jié)束，溴化乙錠染色5-10分鐘。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照。
8. PCR產(chǎn)物切膠回收。步驟參見膠回收Kit說明書。
A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。具體操作步驟如下，詳見說明書。
1）稱回收的膠，每0.1g加100µL XP2 ；
2）55度5-7分鐘至完全溶膠 ；
3）取溶膠液加入回收柱子，最大體積700µL；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加700µl SPW ，10000g 1min；
6）重復(fù)5）；
7）空管離心2min，13000 g
8）干燥，加15-30µL Eulation Buffer
9）13000 g，1min
DNA產(chǎn)物純化kit，操作步驟：
● 將PCR反應(yīng)液（40ul）或酶促反應(yīng)液移至一干凈的1.5ml離心管中，加入5倍體積的buffer3，充分混勻。（用前確定加入適量的異丙醇）
● 將混合液全部移入吸附柱，8000g離心30s；將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱，8000g離心30s（此步驟可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。
● 向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上），9000g離心30s。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。（Wash Solution首次使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇）
● 重復(fù)步驟3一次
● 將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，9000g離心1min。下管扔掉，上管放入1.5ml離心管中，晾干。（殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗(yàn)）
● 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預(yù)熱（進(jìn)一步提高得率）的Elution Buffer（加到濾芯上），室溫靜置1min，9000g離心1min。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。 注意：本步驟中，所有轉(zhuǎn)速單位為g。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對(duì)PCR產(chǎn)物回收。具體操作步驟如下。
● 加入等體積的冰無水乙醇，加入1/10體積的KAc（3M pH5.2）。
● 上下顛倒混勻，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。
● 棄上清，加入70%的冰乙醇，輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min。
● 棄上清，室溫干燥，至無乙醇。
● 加入適量體積的ddH2O。
六、注意事項(xiàng)
1. 進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，注意加入試劑的順序。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實(shí)驗(yàn)使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀釋：分子量24bp*324.5 = 7788，質(zhì)量數(shù)10OD*33 ＝33ug，摩爾數(shù)=33/7788 =4.2 nmol，母液濃度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L，使用時(shí)取母液稀釋5倍，則終濃度為10μmol/L。
4. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物共20μL，其中2-5 μL用于檢測，剩余的用于純化回收。
5. 使用自己的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增的學(xué)生，請?zhí)崆皽?zhǔn)備引物和模板。
附1：基因序列查找和PCR引物設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行之前，需要利用NCBI查找基因序列，并設(shè)計(jì)PCR引物。
● 進(jìn)入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）后，在Search的下拉框中選擇Nucleotide，再輸入基因名稱，點(diǎn)擊Search即可。也可輸入具體的物種名以縮小范圍，獲得cDNA 序列信息。 例如：水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（Oryzacystatin, OC）序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCG
TTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGA
TGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGG
CCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAAC
AGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGG
GCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTAC
GAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCC
TCGACGACGCCACCGCCTAA
● 引物設(shè)計(jì)。要求擴(kuò)增上述完整的cDNA 序列，并在兩端添加酶切位點(diǎn)，5‘添加EcoRI（GAATTC）， 3‘端添加HindIII （AAGCTT）。以便克隆到pET30a的相應(yīng)位點(diǎn)。 注意PCR產(chǎn)物中沒有上述酶切位點(diǎn)，否則不能使用。
prim-OC2-R GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC 26bp 下劃線為EcoRI識(shí)別序列
#prim-OC2-F GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC 26bp 下劃線為HindIII 識(shí)別序列
T載體通用引物
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