1. 簡介

MIQE (Minimum Information for Publication of Ouantitative Real-Time PCR Experiments) 指南是關(guān)于qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)表文章時(shí)所必需的實(shí)驗(yàn)信息提出的最低限度的標(biāo)準(zhǔn)。目的是讓作者能夠設(shè)計(jì)和報(bào)告更有價(jià)值的qPCR實(shí)驗(yàn)，使評閱人員和編輯按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)來評價(jià)所提交的文稿的技術(shù)質(zhì)量，使讀者更容易重復(fù)按照該指南發(fā)表的實(shí)驗(yàn)研究。本文小編將為大家詳細(xì)介紹如何應(yīng)用MIQE指南來指導(dǎo)RT-qPCR中的定量策略。
 

2. 前言

當(dāng)準(zhǔn)備進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要確定實(shí)驗(yàn)該如何設(shè)計(jì)，要做絕對定量還是相對定量呢？絕對定量要怎么做？相對定量又是怎么做？本文將重點(diǎn)介紹量化策略類型的優(yōu)缺點(diǎn)，從而深入了解其局限性以及RT-qPCR效率如何影響量化結(jié)果。
 

3. 定量策略

絕對定量使用標(biāo)準(zhǔn) (或校準(zhǔn)) 曲線將PCR數(shù)據(jù)與輸入拷貝數(shù)相關(guān)聯(lián)。因此，該校準(zhǔn)曲線用于確定未知分析物的濃度。盡管傳統(tǒng)上稱為 “絕對定量”，但最好將這種方法稱為 “校準(zhǔn)定量”。這是因?yàn)椋�在這種情況下，“絕對” 一詞具有誤導(dǎo)性，因?yàn)楝F(xiàn)場樣品的濃度實(shí)際上是與校準(zhǔn)曲線中使用的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度 “相對” 測量的。此外，數(shù)據(jù)的可靠性還依賴于RT-qPCR中待測靶標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的 “相同” 的擴(kuò)增效率。

相對定量不需要校準(zhǔn)曲線。由于這個(gè)原因，乍看比絕對定量更容易執(zhí)行。相對定量用于測量mRNA表達(dá)相對于所選對照樣品的變化，它主要基于靶基因相對于一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性表達(dá)參考基因（管家基因）的表達(dá)。相對定量方法對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖亲銐虻�，例如研究mRNA或microRNA基因在不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)變化。用于表示相對量的單位通常為 “x倍變化”，并且可以在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中比較相對量。
 

▲ 圖1 符合MIQE指南的RT-qPCR定量檢測
 

4. 絕對定量

絕對定量需要用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣品的量，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的Cq值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Cq= -klgX₀+b。對未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的Cq值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。
 

▲ 圖2 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線
 

從上圖可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板起始濃度越大時(shí)，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時(shí)，Cq值越大。

為了保持與實(shí)際檢測樣品間的擴(kuò)增效率的一致性，作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量選擇與實(shí)際檢測樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品。以基因組DNA為模板時(shí)就要選擇基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品；進(jìn)行mRNA表達(dá)解析時(shí)最好選擇表達(dá)目的基因的Total RNA(或以Total RNA為模板合成的cDNA)作為標(biāo)準(zhǔn)品。即使擴(kuò)增堿基序列相同，但整體模板不同，也有可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率不同（比如基因組DNA和質(zhì)粒DNA等）。

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5個(gè)以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。最后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程：Cq=-klgX₀+b，其中X₀為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，確定其拷貝數(shù)。

 

5. 相對定量

相對定量是用于測定兩個(gè)或多個(gè)不同樣品中靶基因量的差異，得到的數(shù)據(jù)是目的基因在各樣本中含量的相對比例。即將實(shí)驗(yàn)樣本中靶基因的Cq值與對照樣本的Cq值進(jìn)行比較，結(jié)果用實(shí)驗(yàn)樣本中靶基因量與對照樣本中靶基因量的比值或差異倍數(shù)來表示。該方法在qPCR定量檢測mRNA水平中最常見，研究生理變化對基因表達(dá)水平的影響。比如研究不同藥物處理對Actin基因表達(dá)量的影響，就可以使用相對定量方法來研究。

相對定量需要確保實(shí)驗(yàn)樣本與對照樣本的靶基因從等量原料中得到。Cq值與起始樣品模板量的濃度相關(guān)，但是兩組樣品間濃度能否調(diào)至完全相同呢？這就要求樣品細(xì)胞起始數(shù)、RNA 提取效率、逆轉(zhuǎn)錄以及定量效率及操作必須完全一致，不存在操作誤差等，這顯然是無法達(dá)到的。最常用的是引入內(nèi)參基因?qū)�樣本的差異進(jìn)行歸一化。

6. 內(nèi)參基因選擇

選擇合適的單個(gè)參考基因或選擇合適的參考基因組對于準(zhǔn)確的RT-qPCR基因表達(dá)分析是極為關(guān)鍵的，并且是MIQE指南的必需報(bào)告內(nèi)容。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該具備以下幾個(gè)條件：

① 不存在假基因 (pseudogene) ，以避免基因組DNA的擴(kuò)增；

② 高度或中度表達(dá) ，排除太高或低表達(dá)；

③ 穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織 (如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞 )，而且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；

④ 表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān)；

⑤ 其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；

⑥ 不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。

針對在不同條件下表達(dá)差異的基因、呈現(xiàn)細(xì)胞周期性依賴表達(dá)的基因以及定位于X染色體的基因，都不是作為內(nèi)參基因的首要選擇。

7. RT-qPCR數(shù)據(jù)的歸一化

相對定量時(shí)采用內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，然后使用將歸一化的數(shù)值進(jìn)行比較得出差異倍數(shù)。對照樣本的歸一化后靶基因表達(dá)量被設(shè)置為“1”，實(shí)驗(yàn)樣本的歸一化后靶基因表達(dá)量以對比對照樣本增加或降低x倍來表示。

相對定量的數(shù)據(jù)計(jì)算方法通常有2種：相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較Cq值法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法中，先用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定實(shí)驗(yàn)樣本和對照樣本中靶基因和內(nèi)參基因的量，再用內(nèi)參基因歸一化兩個(gè)樣本中靶基因量。相對定量中的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度無需已知。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線法需要每一個(gè)待測基同內(nèi)參基因一起單獨(dú)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，工作量大，成本高，只適合僅分析1個(gè)或幾個(gè)基因的低通量實(shí)驗(yàn)。因此日常實(shí)驗(yàn)中常用的方法是比較Cq值法，即2^-△△Cq法，計(jì)算方法如下：

步驟1：內(nèi)參基因均一化樣本差異

目的基因平均Cq值-內(nèi)參基因平均Cq值=ΔCq

步驟2：處理和對照樣本比較

ΔCq處理樣本-ΔCq對照樣本=ΔΔCq

步驟3：使用公示計(jì)算

倍數(shù)變化=2^-△△Cq

此公式用于計(jì)算所有待測樣本與對照樣本之間目的基因表達(dá)量的倍數(shù)變化，若F值=A（A＞1），則代表待測樣本相對于對照樣本表達(dá)量上調(diào)A倍；反之若F值=B（1＞B＞0），則代表待測樣本相對于對照樣本表達(dá)量下調(diào)1/B倍。

值得注意的是，2^-△△Cq法需保證目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本一致才可使用。同時(shí)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，通過查看擴(kuò)增曲線中指數(shù)增長期是否平行來確定擴(kuò)增效率是否相似；或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一對引物的擴(kuò)增效率。

8. RT-qPCR擴(kuò)增效率

PCR的效率取決于許多因素，既存在抑制劑也存在增強(qiáng)劑，如下圖所示。在所有比較樣品中穩(wěn)定和恒定的擴(kuò)增效率是樣品之間實(shí)現(xiàn)可靠比較的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。

▲ 圖3 影響PCR擴(kuò)增效率的因素
 

一種有效的用來確定 qPCR 實(shí)驗(yàn)是否是最優(yōu)化的方法： 將模板稀釋成一系列濃度梯度進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，用這個(gè)結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，模板可以用已知濃度的樣品(如納克級的基因組DNA 或多個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA)或未知濃度的樣品(如cDNA )。用模板初始量(或未知量樣品的稀釋倍數(shù) )的log值對每個(gè)稀釋樣品的Cq值作圖，兩者呈遞減的線性關(guān)系，稱之為標(biāo)準(zhǔn)曲線。至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個(gè)數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX₀+b。

理論上，一系列稀釋樣品的擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距，如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距由等式2ⁿ=稀釋倍數(shù)決定，這里n是閾值線上擴(kuò)增曲線之間的循環(huán)數(shù)(Cq值) 的差異。例如，10倍稀釋的DNA樣品，2ⁿ = 10，因此，n =3.32，即k=3.32，制作完標(biāo)準(zhǔn)曲線后，需要對其進(jìn)行評估，評估指標(biāo)有兩個(gè)，相關(guān)系數(shù)R²和擴(kuò)增效率（E）。相關(guān)系數(shù)R²反應(yīng)了數(shù)據(jù)的線性關(guān)系，主要用來評估重復(fù)樣品的可重復(fù)性和不同濃度的初始模板是否具有相同的擴(kuò)增效率。R²值應(yīng)大于0.98，該值越接近1，表示線性關(guān)系越好，數(shù)據(jù)越準(zhǔn)確。

擴(kuò)增效率（E）計(jì)算公式：E=10-1/斜率-1。一般認(rèn)為擴(kuò)增效率應(yīng)介于90~110%之間，與之相對應(yīng)的斜率介于-3.58~-3.1之間。

9.  使用效率校正計(jì)算基因表達(dá)倍數(shù)

由于PCR效率在基因、測定、樣品、試劑和儀器之間變化，引入實(shí)時(shí)PCR效率（E）校正有助于提供更準(zhǔn)確的相對定量。然后將相對倍數(shù)變化定義為：

在這種情況下，計(jì)算步驟如下：

1.計(jì)算對照樣品（control）和待測樣品（treatment）之間目的基因（GOI）的Cq差異。

2. 計(jì)算對照樣品（control）和待測樣品（treatment）內(nèi)參基因（REF）的Cq差異。

3. 確定每個(gè)基因（GOI和REF）的PCR擴(kuò)增效率。

4. 相對表達(dá)比（R）代表與未處理對照組相比，一個(gè)GOI經(jīng)歷處理后的“x倍變化”，用REF的穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)行歸一化，計(jì)算中采用REF或GOI基因的最佳PCR效率E。

10. 總結(jié)

用于可靠的mRNA或microRNA定量策略必須根據(jù)需要解決的生物學(xué)問題去設(shè)計(jì)。為了做到真實(shí)、可信和符合MIQE指南要求，所應(yīng)用的定量策略必須經(jīng)過高度優(yōu)化和驗(yàn)證。近年來，科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出許多軟件工具使定量過程標(biāo)準(zhǔn)化并使結(jié)果可再現(xiàn)。這些工具及MIQE指南應(yīng)用最終目的是降低運(yùn)行、檢測和所用SOP之間的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異性。此外，也有利于實(shí)時(shí)RT-PCR平臺(tái)、分析軟件工具之間以及全球不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化和可比性。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟幌嗤�，相對定量和絕對定量各有其不同的應(yīng)用場景。絕對定量更多的應(yīng)用于：病原體檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、基因表達(dá)研究。相對定量則更多的應(yīng)用于：基因在不同組織中的表達(dá)差異、藥物療效考核、耐藥性研究等。

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選擇不同的檢測和驗(yàn)證方法，才是實(shí)驗(yàn)成功的前提。你學(xué)會(huì)了嗎？