基因編輯技術的發(fā)展為科研人員提供了直接靶向和修改活體生物基因序列的方法。該技術通過創(chuàng)建更精確的細胞和動物模型，擴展了我們對人類疾病背后遺傳學的理解。從基礎研究到應用生物技術和生物醫(yī)學研究的各個領域，該技術都極具潛力¹。然而一直以來，將基因編輯工具遞送到靶細胞都是一項極具挑戰(zhàn)的工作。如果有一種安全高效的基因遞送新技術不受內載基因的限制，研究人員將能夠實現(xiàn)基因編輯策略的全部潛力，從而探索癌癥治療的新途徑。

基因編輯的基礎依賴于在感興趣的染色體位點啟動雙鏈斷裂 (DSB)，以觸發(fā)兩種內源性細胞 DNA 修復途徑之一：非同源末端連接 (NHEJ) 或同源定向修復 (HDR)，它們分別導致基因破壞或靶向整合。一直到 2013 年之前，工程核酸酶，如鋅指核酸酶 (ZFN) 和轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALEN) 是用于基因編輯的主導技術。然而，漫長的開發(fā)時間加上相對較低的編輯效率，限制了該領域的發(fā)展速度。

2013 年，來自細菌適應性免疫防御系統(tǒng)的成簇規(guī)律間隔短回文重復序列 (CRISPR)/Cas 相關核酸酶的發(fā)現(xiàn)給基因編輯領域帶來了顛覆性改變。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)使用短鏈向導 RNA (sgRNA) 來引導 Cas9 介導的切割和供體 HDR 模板的插入。相比 ZFN 和 TALEN，重新定位Cas9的RNA設計具有簡單、應用廣泛、易調整等顯著優(yōu)勢，從而開創(chuàng)了基因工程的新時代。隨著基因編輯領域繼續(xù)創(chuàng)新和快速發(fā)展，業(yè)界正在研究替代性或工程化的 CRISPR 核酸酶（即 Cas12 和 dead Cas9）和其他模式，如堿基和引物編輯，以提高效率并減少脫靶效應。

T 細胞的基因工程催生了新的癌癥免疫療法，如嵌合抗原受體 (CAR)-T 細胞療法，徹底顛覆了癌癥治療方法。目前的自體 CAR-T 免疫療法已展現(xiàn)較高的臨床成功率，但該療法的安全性和有效性仍有待提高。下一代 CAR-T 免疫療法的重點是增強 CAR-T 細胞的效力，限制脫靶效應，將治療目標擴展至液體癌以外的癌癥，并從同種異體供體中制造通用 CAR-T 細胞¹。這些新策略需要更復雜的、基于CRISPR/Cas9的基因工程策略，其中所選的基因遞送方法決定著基因編輯的效率、安全性和可擴展性。
 
基于 T 細胞基因編輯的療法可分為體內和離體療法（圖 1）。在體內療法中，基因編輯機器被直接輸入體內。另一方面，在離體療法中，靶細胞被分離、基因工程改造并重新輸回患者體內。雖然病毒載體已在臨床上高效地用于 T 細胞工程，但是該方法存在幾個缺點，例如成本較高、具有潛在的插入突變風險和脫靶效應，這給患者帶來了安全隱患²。就其安全性、簡單性和靈活性而言，非病毒遞送模式已成為病毒載體的優(yōu)質替代方案。


圖 1. 體內和離體基因編輯的示意圖。對于體內基因編輯，基因編輯機器直接輸入體內。對于離體基因編輯，分離靶細胞后，進行基因改造，再重新輸回患者體內。

被長期用于離體遞送的非病毒方法之一就是電穿孔。這種技術利用脈沖高壓電流瞬時打開細胞膜中的納米級通道，將核酸遞送到細胞中。對于 CRISPR/Cas9，需要連續(xù)的電脈沖來分別遞送 Cas9 mRNA 和 sgRNA。這導致需要在效率和細胞存活率之間做出巨大的權衡取舍，使得用電穿孔方法進行一系列或多重基因操作十分困難。

脂質納米粒 (LNP) 則不需要這樣的權衡，這使其成為相比電穿孔更加有效的 RNA 遞送替代方法。LNP 是完全合成的脂質制劑，用于在將 RNA 遞送到靶細胞之前包封和保護 RNA 免受核酸酶降解。RNA-LNP 復合物在結構上與低密度脂蛋白 (LDL) 類似，可以利用 LDL 的內源性攝取途徑，通過受體介導的內吞作用進入靶細胞。這種溫和的攝取機制能夠成功和高效地進行 T 細胞基因工程，與電穿孔方法相比具有一致的高水平基因表達、高轉染效率和高活細胞產量。事實上，臨床階段基因編輯技術領先的企業(yè) Intellia Therapeutics 發(fā)布的數據顯示，在他們的同種異體 TCR-T 和 CAR-T 項目中，LNP 有效地取代了電穿孔向 T 細胞遞送 CRISPR/Cas9 基因編輯物。LNP 避免了多重編輯帶來的染色體易位風險，以及電穿孔對 T 細胞活性的負面影響。

Precision NanoSystems 利用其對 LNP 化學和細胞生物學的深厚知識，設計了一款專用于T細胞基因編輯的LNP 組合物。因為 LNP 特性對生產條件敏感，所以需要對生產過程進行精確且可重復的控制，以確保顆粒生產的一致性。

NanoAssemblr 儀器與GenVoy-ILM™ T Cell Kit for mRNA（可用于 NanoAssemblr Spark™ 和 Ignite™ 儀器）等專用試劑盒配套使用，為研究人員提供所需的工具，幫助他們再自己的實驗室內建立可靠、可擴展的離體基因遞送方法。mRNA-LNP 可以輕松無縫地整合到標準的原代 T 細胞培養(yǎng)工作流程中，以促進從概念到臨床實踐的下一代 CAR-T 細胞療法的生產。
 
多個概念驗證實驗強調了使用 GenVoy-ILM T Cell Kit for mRNA制備的LNP，在進行自體和異體 CAR-T 細胞治療開發(fā)時的有效性和通用性（圖 2）³。


圖 2. LNP 易于整合到離體 CAR-T 細胞基因工程策略中，包括基因表達 (a)、單基因敲除 (b)、雙基因敲除 (c) 和多步驟基因敲除和表達 (d)。

自體細胞療法
在通過 LNP 和電穿孔兩種方法將抗CD19 CAR mRNA 遞送至 T 細胞的對比實驗中，發(fā)現(xiàn)LNP方法的轉染效率 (TE) 顯著高于電穿孔。并且觀察到更高的細胞存活率和同質程度更高的 CAR 表達，這是對 CAR-T 產品的最終細胞產量產生積極影響的重要參數³。研究還表明，與電穿孔和/或慢病毒轉染相比，LNP 介導的 CD19 CAR-T 細胞表現(xiàn)出同等的腫瘤殺傷能力^4,5。

同種異體細胞療法
從健康供體細胞產生的同種異體 CAR-T 細胞產物有潛力克服與自體療法相關的、已論證的缺點，但必須解決宿主同種異體排斥和移植物抗宿主病 (GVHD) 風險等挑戰(zhàn)。使用 LNP 作為遞送載體的 CRISPR/Cas9 基因編輯 支持天然 αβ TCR 的單基因敲除 (KO) 以及 TCR 和 T 細胞標志物 CD52 的雙基因敲除，以允許抗體介導性（抗 CD52）淋巴細胞清除。T 細胞標志物 CD52 的敲除，允許對患者（抗 CD52）進行抗體治療以增強淋巴細胞清除，同時不影響輸入的同種異體 CAR T 細胞，以降低同種異體反應性和 GVHD。此外，使用LNP介導的CRISPR/Cas9進行基因KO的多步驟工程，再進行CAR轉基因表達，成功產生了功能性強的 TCR–CD19 CAR-T 細胞，證明其在體外可以有效殺傷腫瘤細胞³。

在各種基因改造場景中，LNP 介導的基因遞送表現(xiàn)出的簡易性為研究人員提供了相較于病毒載體和電穿孔的顯著優(yōu)勢，以加速下一代 CAR-T 細胞療法的發(fā)展。
 
基因遞送平臺需要支持多種多樣的基因策略來開發(fā)新的基因藥物。隨著該領域將重點轉向解決新的疾病靶點，并致力于同種異體方法以開發(fā)“現(xiàn)成”的產品來服務更多的患者群體，需要多重或順序基因操作的工作流程變得越來越普遍。LNP 正在多個基因編輯項目中用于臨床評估。Intellia Therapeutics 公司正在臨床管線中加速推進基于LNP CRISPR系統(tǒng)的體內和離體產品。OTQ923/HIX763 專注于造血干細胞的離體基因編輯以治療鐮狀細胞疾病，而公司領先的、用于治療甲狀腺素運載蛋白 (ATTR) 淀粉樣變性的體內基因編輯候選物NTLA-2001，已報道初步臨床結果頗具前景。

病毒載體和電穿孔有諸多缺點，例如內載基因長度受限、細胞活性低和轉染效率欠佳。LNP 是一種經過臨床驗證的可擴展技術，已用于制備FDA 批準的COVID-19 mRNA 疫苗，和第一種基于小干擾 RNA 的藥物 ONPATTRO® (patisiran)。這種遞送技術已被證明在基因遞送和編輯應用上，具有有效性、溫和性和可擴展性，有助于在快速發(fā)展的臨床環(huán)境中加速 T 細胞療法研究和藥物開發(fā)。


掃描以下二維碼，即可觀看Fraunhofer IZI 先進療法產品 (ATMP) 工程部負責人Sandy Tretbar 博士為我們帶來的前沿分享：基于 mRNA-LNP的嵌合抗原受體的瞬時表達，可用于安全免疫治療
 
參考文獻

1) Li H, Yang Y, Hong W, Huang M, Wu M, Zhao X. Applications of genome editing technology in the targeted therapy of human diseases: mechanisms, advances and prospects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):1. Published 2020 Jan 3. doi:10.1038/s41392-019-0089-y

2) Xu X, Wan T, Xin H, et al. Delivery of CRISPR/Cas9 for therapeutic genome editing. J Gene Med. 2019;21(7):e3107. doi:10.1002/jgm.3107

3) Precision Nanosystems. Genome Editing of Human Primary T Cells with Lipid Nanoparticles. Application Note: CRISPR-AN-0322

4) Billingsley MM, Hamilton AG, Mai D, et al. Orthogonal Design of Experiments for Optimization of Lipid Nanoparticles for mRNA Engineering of CAR T Cells. Nano Lett. 2022;22(1):533-542. doi:10.1021/acs.nanolett.1c02503

5) Billingsley MM, Singh N, Ravikumar P, Zhang R, June CH, Mitchell MJ. Ionizable Lipid Nanoparticle-Mediated mRNA Delivery for Human CAR T Cell Engineering. Nano Lett. 2020;20(3):1578-1589. doi:10.1021/acs.nanolett.9b04246