葡萄糖是機體能量的主要來源，經(jīng)過代謝產(chǎn)生ATP支持各種生命活動，如酶促合成、胞內(nèi)運輸、細胞增殖等。然而，它在控制蛋白質(zhì)相互作用方面的作用沒有得到重視。

2022年11月，斯坦福大學的研究人員在bioRxiv上刊發(fā)了題為“Glucose modulates transcription factor dimerization to enable tissue differentiation”的文章，發(fā)現(xiàn)葡萄糖會在包括表皮在內(nèi)的多種組織的分化細胞中積累并未引起代謝的增加，暗示葡萄糖本身可以作為分化過程的分子信號，作者還發(fā)現(xiàn)葡萄糖可以直接結(jié)合分化轉(zhuǎn)錄因子IRF6，增強分化基因的誘導。上述觀察表明葡萄糖的直接結(jié)合可能重塑分化必需蛋白的功能。

上述發(fā)現(xiàn)促使該團隊繼續(xù)找尋新的葡萄糖結(jié)合蛋白。2023年1月，該課題組在Cell發(fā)表了題為“Glucose dissociates DDX21 dimers to regulate mRNA splicing and tissue differentiation”的研究，發(fā)現(xiàn)葡萄糖解聚DDX21二聚體來調(diào)節(jié)mRNA剪接和組織分化。

研究人員確定了葡萄糖與各種RNA結(jié)合蛋白（RBP）的結(jié)合，包括DDX21 RNA螺旋酶，該酶被認為對表皮分化至關(guān)重要。葡萄糖與DDX21的ATP結(jié)合域結(jié)合，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，抑制了螺旋酶的活性，并使DDX21二聚體解離。在分化過程中，葡萄糖的升高與DDX21從核仁到核質(zhì)的重新定位有關(guān)，DDX21在核質(zhì)中組裝成含有RNA剪接因子的較大的蛋白質(zhì)復合物。DDX21以葡萄糖依賴的方式定位于mRNA內(nèi)含子中特定的SCUGSDGC結(jié)構(gòu)域，并促進關(guān)鍵的促分化基因的剪接，包括GRHL3、KLF4、OVOL1和RBPJ。上述發(fā)現(xiàn)揭示出葡萄糖在調(diào)節(jié)組織分化相關(guān)的RNA解旋酶二聚化和功能中的作用機制。

 

1、DDX21作為葡萄糖的直接結(jié)合蛋白

研究通過兩種方法確定葡萄糖互作蛋白：1）親和層析純化葡萄糖結(jié)合蛋白；2）利用點擊化學反應抓取天然細胞內(nèi)可與疊氮葡萄糖結(jié)合的蛋白（圖1A）。經(jīng)質(zhì)譜分析獲得目的蛋白，兩種方法同時捕獲到的蛋白共有91種，其中大部分為RNA結(jié)合蛋白，含量最豐富的是DDX21（圖1B、C）。由于RNA解旋酶的結(jié)構(gòu)十分保守，層析法中還富集到另外31種RNA解旋酶，說明解旋酶是一類新發(fā)現(xiàn)的葡萄糖結(jié)合蛋白。接著通過微量熱泳動（MST）（圖1D）和熒光淬滅（Fluorescence quenching）（圖1E）分析證實葡萄糖可結(jié)合DDX21，親和力在微摩爾級別。

圖1 篩選葡萄糖直接結(jié)合的蛋白

2、葡萄糖結(jié)合到DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域影響其核仁到核質(zhì)的重定位

ATP酶活性實驗顯示葡萄糖和ATP競爭結(jié)合DDX21（圖2A），突變體結(jié)合實驗提示DDX21結(jié)合葡萄糖需要其ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的某些序列（圖2B）。分子對接（圖2C）和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析（圖2D）確認葡萄糖結(jié)合DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。微量熱泳動（MST）（圖2E）、免疫共沉淀和非變性膠實驗顯示葡萄糖可抑制DDX21的二聚化。活細胞中的臨近連接實驗（PLA）顯示在細胞分化過程中胞內(nèi)的葡萄糖濃度升高，DDX21二聚體出現(xiàn)得更少，免疫熒光顯示DDX21單體主要存在于核質(zhì)（圖2F）。總之，葡萄糖結(jié)合到DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域會改變其蛋白構(gòu)象，影響其核仁到核質(zhì)的重定位。

圖2 葡萄糖結(jié)合到DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域影響其核仁到核質(zhì)的重定位

 

最后，作者通過敲除實驗證實DDX21是表皮分化必需的。進一步分析DDX21在葡萄糖調(diào)控的mRNA剪接中的作用，發(fā)現(xiàn)葡萄糖可能促使DDX21結(jié)合到某些特定的mRNA內(nèi)含子以促使其剪接，而DDX21調(diào)節(jié)分化過程中的RNA剪接至少部分是通過直接結(jié)合葡萄糖來實現(xiàn)的，如對表皮分化和功能相關(guān)基因（如GRHL1-3、KLF4、OVOL1、RBPJ、JAG1、NOTCH3），DDX21會改變其分化相關(guān)外顯子的使用或內(nèi)含子的保留。

葡萄糖抑制DDX21二聚化發(fā)揮作用的模式圖如下：

葡萄糖抑制DDX21二聚化發(fā)揮作用的模式圖

 

                                                           總結(jié)與討論

該研究挑戰(zhàn)了人們對葡萄糖的固有認知并提出代謝物可作為蛋白功能調(diào)節(jié)器的可能性，同時推測葡萄糖很可能還參與多種細胞過程的調(diào)節(jié)，并可能影響基因表達的不同步驟，從轉(zhuǎn)錄到轉(zhuǎn)錄后RNA代謝。代謝物不僅是機體表型的標志物，還可與蛋白直接結(jié)合調(diào)控蛋白功能，改變疾病相關(guān)信號通路，影響疾病進展。前期我們已經(jīng)分享過一篇文獻“代謝組學研究2.0時代已經(jīng)到來：發(fā)現(xiàn)代謝小分子的靶點蛋白是關(guān)鍵”，其中列舉了多篇高水平的文章，并揭示通過發(fā)現(xiàn)代謝物的直接作用靶點用以解釋代謝物的功能已成為高水平研究的標配。

在此，達吉特可通過代謝組學技術(shù)幫助大家實現(xiàn)相關(guān)代謝物的確定：

1）有機酸和TCA循環(huán)類物質(zhì)檢測，包括葡萄糖、乳糖、丙酮酸、琥珀酸等13種代謝物；

2）能量代謝類物質(zhì)檢測列表，包括糖酵解、戊糖磷酸途徑、TCA循環(huán)、其他氨基酸等26種代謝物；

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2、代謝物小分子的直接靶點篩選與驗證

在確定代謝物小分子以后，可通過20K人類蛋白質(zhì)組芯片、Pull down+MS、DARTS+MS等技術(shù)實現(xiàn)對代謝物直接靶蛋白的篩選，進一步可通過分子對接、SPR、ITC、CETSA、Pulldown+WB等方法進行驗證，而其中最常用的驗證手段為SPR。

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相關(guān)文獻

Miao W, Porter DF, Lopez-Pajares V, et al. Glucose dissociates DDX21 dimers to regulate mRNA splicing and tissue differentiation. Cell. 2023 Jan 5;186(1):80-97.e26.