分辨組織樣本的結(jié)構(gòu)，了解顯微鏡在病理學(xué)應(yīng)用中的多種功能

談到顯微鏡在病理學(xué)家日常工作中的用處時(shí)，我們通常會(huì)想到診斷。除了病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作流的這一階段，顯微鏡在更早期的階段也發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員或病理學(xué)家使用顯微鏡檢查樣本染色 情況。

如果樣本不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下只能看到組織切片或涂片標(biāo)本的基本結(jié)構(gòu)，但卻無法看到進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。對(duì)于對(duì)比度不足的非常薄的切片尤其如此，有時(shí)幾乎是半透明狀態(tài)。 

圖1：圖像中所示為未染色的組織切片。沒有蘇木精和伊紅等染色，幾乎無法識(shí)別不同的細(xì)胞類型或組織結(jié)構(gòu)，也就很難從圖像中獲取有用信息，甚至無法進(jìn)行有效的診斷。

經(jīng)染色處理后，樣本的不同部分顯示為不同的顏色和染色強(qiáng)度，從而使組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)可見。最常見的染色組合是蘇木精和伊紅，簡稱為H&E染色。

圖2：載玻片浸入不同的溶液中進(jìn)行染色。
 

H&E染色的原理

H&E染色前，首先要對(duì)組織進(jìn)行固定、脫水、包埋和切片處理，然后將切片貼到載玻片上。染色前，一般需要使用二甲苯等溶劑移除包埋介質(zhì)，通常為固體石蠟。然后將切片通過分級(jí)醇溶液，降低濃度并置于水中對(duì)切片補(bǔ)水。

在下一步中，將切片浸入蘇木精溶液中，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色的強(qiáng)度取決于組織類型、切片厚度、浸泡時(shí)間等因素。觀察玻片的病理學(xué)家的偏好也有影響。用水沖洗后，用藍(lán)色染色液將蘇木精的紅染色變?yōu)樗{(lán)色。 

圖3：圖中顯示了40倍放大倍率下十二指腸內(nèi)的細(xì)胞核。它們使用蘇木精染為藍(lán)色。盡管組織內(nèi)的細(xì)胞很密集，伊紅產(chǎn)生的淡粉色染色依然能夠顯示組織內(nèi)的皺褶和其它結(jié)構(gòu)。

 

檢查強(qiáng)度和背景染色

在顯微鏡下快速觀察后，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員或病理學(xué)家便可判斷染色是否充分或過度。如果染色不充分，便需要在蘇木精中再次浸染。如果染色濃度過強(qiáng)，切片顯示背景染色，他們會(huì)使用酸性溶液淡化染色，實(shí)現(xiàn)切片染色的差異化。這一步驟后，需要再次使用藍(lán)色染液并在自來水下沖洗。 

下一步是伊紅染色。伊紅是蘇木精的復(fù)染劑，可差異化地染出紅細(xì)胞、膠原，并通過粉色展現(xiàn)出平滑肌。分化同樣需要根據(jù)組織的情況用水洗去過量的伊紅。然后將染色后的玻片浸入梯度乙醇中，再浸入二甲苯，對(duì)玻片脫水。完成染色和脫水后，使用封片劑來封裝切片。 

 

何時(shí)檢查染色 

究竟是在蘇木精染色后在顯微鏡下檢查染色和分化，還是在伊紅染色后，不同的方案做法也不同。在蘇木精染色后檢查，無論是再次浸染還是重復(fù)分化，都方便立即調(diào)整。在伊紅染色后檢查，可以讓實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員或病理學(xué)家對(duì)全染色玻片有一個(gè)更好的了解。 

快速檢查在實(shí)驗(yàn)室工作流中具有重要的作用，可以確保負(fù)責(zé)診斷的病理學(xué)家看到需要的細(xì)節(jié)信息。

 

可見結(jié)構(gòu)

使用明場(chǎng)照明可以觀察H&E染色玻片。蘇木精將細(xì)胞核染為藍(lán)紫色，伊紅將細(xì)胞質(zhì)和結(jié)締組織染為淺粉色。借助染色，病理學(xué)家可以輕松辨別不同的組織類型，例如肌肉或結(jié)締組織，并發(fā)現(xiàn)切片中的畸形或不規(guī)則情況。這可以幫助它們識(shí)別反應(yīng)特定的病理的變化，例如感染、慢性炎癥或惡性腫瘤。借助可見信息，病理學(xué)家可以觀察到組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，從而確定疾病的性質(zhì)和進(jìn)展。

圖4：5倍放大倍率下的總覽圖顯示了十二指腸中的三層組織：漿膜、粘膜下層和粘膜區(qū)域。每個(gè)區(qū)域?qū)μK木精和伊紅會(huì)有不同的反應(yīng)，因此借助染料可以輕松辨別邊界層。為識(shí)別潛在病灶，關(guān)鍵是要準(zhǔn)確確定發(fā)生病理變化的確切組織部位和細(xì)胞類型。

圖5：40倍放大倍率下的十二指腸顯示了粘膜下層和粘膜區(qū)域之間的邊界。通過H&E染色，可以輕松辨別不同的細(xì)胞類型。一種細(xì)胞突破兩個(gè)組織隔室之間的天然障礙，通常為癌癥進(jìn)展的一種常見指示。

 

顏色差異

染色工作流和診斷中使用的顯微鏡需要可以很好的辨別顏色差異，這對(duì)及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷至關(guān)重要。檢查染色時(shí)，通常使用小尺寸的獨(dú)立正置顯微鏡，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室工作臺(tái)一般都比較擁擠。 

診斷使用的顯微鏡則應(yīng)配置性能優(yōu)異的相機(jī)，以便拍攝到報(bào)告和歸檔所需的細(xì)微的顏色差異。注釋功能也有助于創(chuàng)建報(bào)告。如果您想了解更多關(guān)于適當(dāng)臨床顯微鏡的信息，可以閱讀文章“如何選擇臨床顯微鏡”。

 

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