摘要：建立了玉米的一步法提取6類(lèi)真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的分析方法，共分析了96份玉米中6類(lèi)真菌毒素的污染情況及地域分布情況，為監(jiān)測(cè)飼料質(zhì)量提供技術(shù)指導(dǎo)。稱(chēng)取的樣品添加6類(lèi)真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)，以84%乙腈水和50%甲醇水作為提取試劑，以2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水為流動(dòng)相梯度洗脫，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。94份玉米中6類(lèi)真菌毒素的檢出率為98%，單種毒素檢出率最高的是伏馬毒素B1和B2，高達(dá)88%，嘔吐毒素和赭曲霉毒素A檢出率最低，均未檢出。伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的最高殘留量分別是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范圍廣，污染較嚴(yán)重的特點(diǎn)。建立的6類(lèi)真菌毒素檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，結(jié)果分析對(duì)玉米中真菌毒素污染檢測(cè)和防控具有重要意義。
關(guān)鍵詞：真菌毒素、液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜、污染情況、真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)
 
  真菌毒素屬于真菌的代謝產(chǎn)物，幾乎可以污染所有的農(nóng)作物，會(huì)損害動(dòng)物體的肝臟、腎臟及皮膚組織等，進(jìn)而通過(guò)食物鏈的形式影響到人體的健康。[1]已知的真菌毒素多達(dá)300種以上，目前多個(gè)國(guó)家均建立了飼料中真菌毒素的限量要求，[2-3]我國(guó)已于2017年推出國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，并于2018年實(shí)施，其對(duì)黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1和B2、T-2毒素等做出明確的檢測(cè)方法規(guī)定和限量要求。本文采用94份玉米為樣本，對(duì)這6類(lèi)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)和污染情況分析。為多毒素的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持的同時(shí)，也為飼料中真菌毒素污染的監(jiān)測(cè)和防控提供幫助。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，通過(guò)加入同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正的手段，開(kāi)發(fā)6類(lèi)真菌毒素的檢測(cè)方法，并對(duì)94份玉米樣品進(jìn)行6類(lèi)真菌毒素的檢測(cè)及污染情況分析。
 
1.材料
 
1.1儀器 TSQ Quantis液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、KS-7200DE超聲波提取儀和TGL-16M高速冷凍離心機(jī)
 
1.2試劑 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1和B2和T-2毒素
 
真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)：黃曲霉毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)、嘔吐毒素同位素內(nèi)標(biāo)、玉米赤霉烯酮同位素內(nèi)標(biāo)、赭曲霉毒素A同位素內(nèi)標(biāo)、伏馬毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)、伏馬毒素B2同位素內(nèi)標(biāo)和T-2毒素同位素內(nèi)標(biāo)
 
1.3樣品 
96份玉米種類(lèi)及地域分布（樣品來(lái)源于全國(guó)近30個(gè)省份及地區(qū)）
 
96份玉米種類(lèi)涉及青農(nóng)1801、鄭單958、萬(wàn)盛189、登海W189、洛玉16、中選777等。依據(jù)我國(guó)區(qū)域劃分方式將94份玉米的分布區(qū)域進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)

區(qū)域	省份	份數(shù)
華東地區(qū)	山東、江蘇、安徽、浙江、福建、上海	22
華南地區(qū)	廣東、廣西、海南	10
華中地區(qū)	湖南、湖北、河南、江西	12
華北地區(qū)	北京、天津、河北、山西、內(nèi)蒙古	17
西南地區(qū)	四川、云南、西藏、重慶	12
西北地區(qū)	寧夏、新疆、青海、陜西、甘肅	10
東北地區(qū)	黑龍江、吉林、遼寧	11

2.方法
2.1色譜及質(zhì)譜條件：
色譜柱： Hypersil GOLD C18 （100*2.1 3um）
流動(dòng)相： 2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脫嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮
梯度表1

時(shí)間	流速mL/min	2mM乙酸銨0.1%甲酸水	甲醇
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
3.5	0.3	30	70
4	0.3	30	70
5	0.3	5	95
9	0.3	5	95
10	0.3	70	30

梯度表2

時(shí)間	流速mL/min	水	乙腈
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
3.5	0.3	30	70
4	0.3	30	70
5	0.3	5	95
9	0.3	5	95
10	0.3	30	70

 
采用ESI離子源，分別用正離子模式掃描和負(fù)離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集數(shù)據(jù)，6類(lèi)真菌毒素及其對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)下表：
 
6類(lèi)真菌毒素及其對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

毒素名稱(chēng)	母離子m/z	子離子m/z	碰撞電壓/V	射頻透鏡 電壓/V	采集模式
FB1	722.3	334/352	40/36	279	[M+H]+
13C-FB1	756	356/373/374/737	39/34/35/26	180	[M+H]+
FB2	706.35	318/336	35/39	243	[M+H]+
13C-FB2	740.7	340/358/376/723	40/38/34/28	216	[M+H]+
AFB1	313.1	241/269/285	38/32/23	176	[M+H]+
13C-AFB1	330	255/284/301	39.7/32.8/24.1	181	[M+H]+
OTA	404.088	193/221/239/241/358	43/37/24/20/15	143	[M+H]+
13C-OTA	424	250/377	27/14	140	[M+H]+
T-2	484.21	185/215/305	22/19/13	109	[M+NH4]+

 

毒素名稱(chēng)	母離子m/z	子離子m/z	碰撞電壓/V	射頻透鏡電壓/V	采集模式
13C-T-2	508.4	198/229/322	22/19/14	121	[M+NH4]+
DON	295	138/265	17/12	109	[M-H]-
13C-DON	310	145/279	14/12	109	[M-H]-
ZON	317	131/175/273	30/24/19	170	[M-H]-
13C-ZON	335	140/185/290	31/25/19	178	[M-H]-

 
注：FB1為伏馬毒素B1簡(jiǎn)寫(xiě)（下同），F(xiàn)B2為伏馬毒素B2簡(jiǎn)寫(xiě)，AFB1為黃曲霉毒素B1簡(jiǎn)寫(xiě)，OTA為赭曲霉毒素A簡(jiǎn)寫(xiě)，T-2位T-2毒素簡(jiǎn)寫(xiě)，DON為嘔吐毒素簡(jiǎn)寫(xiě)，ZON為玉米赤霉烯酮簡(jiǎn)寫(xiě)；13C為其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)簡(jiǎn)寫(xiě)
 
2.2標(biāo)準(zhǔn)品的配制 
 
2.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)品配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為2.4ppm、黃曲霉毒素B1濃度為80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、嘔吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混標(biāo)
 
2.2.2同位素內(nèi)標(biāo)配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為240ppb、黃曲霉毒素B1濃度為8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、嘔吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)品
 
2.3樣品處理
 
稱(chēng)取5g樣品各兩份，加入同位素內(nèi)標(biāo)100uL，其中一份加入20mL84%乙腈水，另一份加入20mL50%甲醇水，超聲波震蕩提取20min，6000r/min離心5min，上清液過(guò)0.22um有機(jī)濾膜，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。
 
3.結(jié)果分析
3.1譜圖 3.2回收率

項(xiàng)目	FB1	FB2	AFB1	ZON	DON	T-2	OTA
添加水平	600ng/g	600ng/g	20ng/g	400ng/g	800ng/g	400ng/g	40ng/g
回收率	83.6%	80.4%	101.8%	109.8%	88.0%	91.3%	86.9%

 
3.3線性

項(xiàng)目	相關(guān)系數(shù)	線性范圍/ng	線性方程
FB1	0.9991	0.19-100	y = 219.68x - 1206.9
FB2	0.9996	0.19-100	y = 911.45x - 1989.7
AFB1	0.9993	0.049-40	y = 61482x + 6.8125
ZON	0.9995	0.094-35	y = 8008.3x - 42517
DON	0.9999	2-450	y = 2755.5x - 796.14
T-2	0.9994	0.1-100	y = 110254x - 63112
OTA	0.9997	0.01-20	y = 1824.1x + 1.5954

 
3.4整體污染情況
 
對(duì)96份玉米的6類(lèi)真菌毒素檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有這6類(lèi)真菌毒素，10份玉米只含有1類(lèi)真菌毒素，32份玉米含有2類(lèi)真菌毒素，44份玉米含有3類(lèi)真菌毒素，6份玉米含有4類(lèi)真菌毒素。
 
污染情況占比圖  
 
3.5區(qū)域分布情況
 
依據(jù)94份樣品分布區(qū)域進(jìn)行劃分，對(duì)6種真菌毒素進(jìn)行分析匯總（匯總表見(jiàn)下），西北地區(qū)玉米受真菌毒素污染的種類(lèi)最少，污染程度最低；華中地區(qū)、華北地區(qū)、西南地區(qū)和東北地區(qū)毒素污染情況較重；華東地區(qū)和華南地區(qū)玉米受真菌毒素污染的種類(lèi)和程度最高。
 

毒素種類(lèi)	華東	華南	華中	華北	西南	西北	東北	總計(jì)
0	0	0	0	0	0	2	0	2
1	2	0	0	1	1	5	1	10
2	6	2	6	7	4	1	6	32
3	13	5	6	9	5	2	4	44
4	1	3	0	0	2	0	0	6
5	0	0	0	0	0	0	0	0
6	0	0	0	0	0	0	0	0
總計(jì)	22	10	12	17	12	10	11	94

 
3.6超限情況
3.6.1
對(duì)96份玉米的6類(lèi)真菌毒素檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，依據(jù)GB 13078-2017 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限量要求進(jìn)行超限判斷（表1），超限樣品共計(jì)14份，其中9份樣品一類(lèi)真菌毒素超限，剩余5份樣品兩類(lèi)真菌毒素超限。針對(duì)赭曲霉毒素和T-2毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：伏馬毒素B1+B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數(shù)分別為：3份、2份、11份和3份，其對(duì)應(yīng)的超限率分別為3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
 
表1 部分飼料原料中6類(lèi)真菌毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及限量要求

項(xiàng)目	產(chǎn)品名稱(chēng)	檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)	限量
黃曲霉毒素B1	玉米加工產(chǎn)品、花生餅	NY/T 2071	≤50ug/kg
赭曲霉毒素A	谷物及其加工產(chǎn)品	GB/T 30957	≤100ug/kg
玉米赤霉烯酮	玉米及其加工產(chǎn)品	NY/T 2071	≤0.5mg/kg
嘔吐毒素	植物性飼料原料	GB/T 30956	≤5mg/kg
T-2毒素	植物性飼料原料	NY/T 2071	≤0.5mg/kg
伏馬毒素B1+2	玉米及其加工產(chǎn)品	NY/T 1970	≤60mg/kg

3.6.2
對(duì)96份玉米的6類(lèi)真菌毒素檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，依據(jù)GB 2761-2017 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量要求進(jìn)行超限判斷（表2），超限樣品共計(jì)46份，其中25份樣品一類(lèi)真菌毒素超限，剩余21份樣品兩類(lèi)真菌毒素超限。針對(duì)赭曲霉毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數(shù)分別為：4份、35份和28份，其對(duì)應(yīng)的超限率分別為4.3%、37.2%和29.8%。
 
表2 部分食品中6類(lèi)真菌毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及限量要求

項(xiàng)目	食品類(lèi)別	檢驗(yàn)方法	限量
黃曲霉毒素B1	玉米、玉米面及玉米制品	GB 5009.22	20ug/kg
赭曲霉毒素A	谷物及其制品	GB 5009.96	5.0ug/kg
玉米赤霉烯酮	玉米、玉米面（渣、片）	GB 5009.209	60ug/kg
嘔吐毒素	玉米、玉米面（渣、片）	GB 5009.111	1000ug/kg

 
 
3.7 單類(lèi)毒素分析
 
由于所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素，故只對(duì)其余四類(lèi)真菌毒素進(jìn)行單獨(dú)分析94份玉米中6類(lèi)毒素污染情況對(duì)比圖
   
3.7.1 伏馬毒素B1+B2
對(duì)96份玉米的伏馬毒素B1和B2檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為88份，占比93.6%，檢測(cè)結(jié)果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg，中位值為6.41mg/kg；整體污染水平為10.9mg/kg，陽(yáng)性污染水平為11.6mg/kg。
 
3.7.2 黃曲霉毒素B1
對(duì)96份玉米的黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為29份，占比30.9%，檢測(cè)結(jié)果在2.20ug/kg-76.4ug/kg，中位值為4.58ug/kg；整體污染水平為3.48ug/kg，陽(yáng)性污染水平為11.3ug/kg。
 
3.7.3 玉米赤霉烯酮
對(duì)96份玉米的玉米赤霉烯酮檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為56份，占比59.6%，檢測(cè)結(jié)果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg，中位值為98.3mg/kg；整體污染水平為329mg/kg，陽(yáng)性污染水平為552mg/kg。
 
3.7.4 嘔吐毒素
對(duì)96份玉米的嘔吐毒素檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為56份，占比59.6%，檢測(cè)結(jié)果在0.1mg/kg-7.0mg/kg，中位值為1.0mg/kg；整體污染水平為0.8mg/kg，陽(yáng)性污染水平為1.4mg/kg。
 
4討論
目前，從技術(shù)角度講，飼料中真菌毒素檢測(cè)共涉及到6大類(lèi)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)4項(xiàng)，前處理方法不一，凈化產(chǎn)品各異，對(duì)人員、操作、設(shè)備要求苛刻，給檢測(cè)帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)；從污染根源分析，一種真菌可能產(chǎn)生多種毒素，一種原料會(huì)受到多種真菌感染，往往是單個(gè)飼料樣品需要檢測(cè)多種真菌毒素；從現(xiàn)實(shí)情況來(lái)看，飼料受真菌毒素污染情況較嚴(yán)重，且分布不均勻，需要加強(qiáng)其毒素監(jiān)測(cè)。本文所述的一步法檢測(cè)，采用直提的方式，同位素校正的手段，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，最大程度降低操作難度，縮短檢測(cè)周期，同時(shí)也控制了實(shí)驗(yàn)成本。
綜上，本文不僅為飼料中6類(lèi)真菌毒素的檢測(cè)提供有效的方法支撐，同時(shí)也為飼料中真菌毒素殘留的檢測(cè)方向提供指導(dǎo)，為保證飼料產(chǎn)品的質(zhì)量提供幫助。
 
 
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