原代細胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)這樣或那樣的問題，客戶遇到的問題從細胞生長角度來說，針對細胞不貼壁、生長緩慢、生長不好，甚至死亡的原因，我們做以下分析并提出相對應(yīng)的解決方法。

一、培養(yǎng)細胞不貼壁

可能原因：

●胰蛋白酶消化過度

●支原體污染

●培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）

●細胞老化

●接種細胞起始濃度太低或太高

解決方法：

●縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度

●分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

●使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2

●啟用新的保種細胞

●調(diào)節(jié)*接種細胞濃度

二、懸浮細胞成簇

可能原因：

●培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子；

●支原體污染；

●蛋白酶過度消化使得細胞裂解；

●DNA污染

解決方法：

●用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕巧吹吸細胞獲得單細胞懸液；

●分離培養(yǎng)物，檢測支原體；

●用DNaseI處理細胞

三、培養(yǎng)原代細胞生長緩慢

可能原因：

●由于更換不同培養(yǎng)液或血清；

●培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；

●培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染；

●試劑保存不當(dāng)；

●接種細胞起始濃度太低；

●細胞已老化；

●支原體污染

解決方法：

●比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗，讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；

●換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子；

●用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；

●血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；

●增加接種細胞起始濃度；

●換用新的保種細胞；

●分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

四、培養(yǎng)細胞生長不好

可能原因：

●細胞本身的狀態(tài)

細胞傳代次數(shù)多，細胞老化；

細胞的接種量：接種量過低，細胞生長緩慢；

細胞傳代時間過晚：細胞中毒，影響傳代后的細胞生長；

胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細胞死亡；時間過短，細胞未*分離而成團，細胞死亡；

細胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速融。

●污染

支原體污染

霉菌污染

●培養(yǎng)基或血清

更換血清或培養(yǎng)基之前未進行驗證

選擇的培養(yǎng)基是否合適

培養(yǎng)基配制是否準確無誤

●原代細胞培養(yǎng)環(huán)境

CO2供應(yīng)是否正常

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確