實(shí)驗(yàn)技術(shù) | PCR實(shí)用tips

瀏覽次數(shù)：1960　發(fā)布日期：2022-12-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis發(fā)明，至今仍廣泛使用的DNA擴(kuò)增技術(shù)。它通過高溫解鏈、低溫退火、中溫?cái)U(kuò)增的過程，來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段DNA的指數(shù)級擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系可以簡單概括為三部分：DNA模板（Template）、引物（Primer）及DNA聚合酶預(yù)混液（PreMix，MasterMix等），其中商業(yè)化的DNA聚合酶產(chǎn)品預(yù)混液已包括濃度優(yōu)化過的DNA聚合酶、三磷酸核苷（NTPs）、Mg2+、緩沖液及惰性染料等，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇擴(kuò)增速度、保真性不同的DNA聚合酶以及預(yù)混染料的產(chǎn)品。整個(gè)體系經(jīng)常為20μL或50μL的體積，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。

PCR熱循環(huán)儀是實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的外部硬件，按照設(shè)定的反應(yīng)程序，利用金屬浴來按時(shí)加熱、冷卻PCR反應(yīng)體系來完成解鏈、退火和擴(kuò)增的過程。溫度和時(shí)間的設(shè)定受引物Tm（DNA Melting Temperature，熔解溫度）、目標(biāo)序列長度及DNA聚合酶擴(kuò)增速度影響。一個(gè)典型的PCR程序如下：

PCR體系組分的Tips：

1. DNA模板a)起始模板含量依據(jù)DNA類型及DNA聚合酶性質(zhì)來決定。一般質(zhì)粒DNA模板起始含量為0.1~1ng，基因組DNA以5-50ng為佳，例如25ng/μL的基因組DNA模板，加1μL左右就夠了。過少的模板會降低得率，過多則會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。b)模板提取過程中，模板完整性受到損壞或提取試劑殘留都可能會導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。PCR反應(yīng)出現(xiàn)不擴(kuò)增或異常時(shí)，可以考慮用電泳檢驗(yàn)DNA完整性以及使用Nanodrop測定DNA純度來排除問題。2. 引物a)引物設(shè)計(jì)對長度、堿基構(gòu)成、序列有很多限制，但目前很多軟件都可以輔助引物設(shè)計(jì)來規(guī)避可能出現(xiàn)的問題。擴(kuò)增引物和用于引入點(diǎn)突變的引物都可以借助軟件來設(shè)計(jì)。b)引物終濃度需要控制在適配DNA聚合酶的范圍內(nèi)，實(shí)際使用時(shí)可以將上下游引物預(yù)混直接加入，減少時(shí)間及槍頭成本哦。3. 水一定要用不含DNA酶（DNase-free）的水，也可以預(yù)混到引物里面，算好濃度和體積就行，體系不足的體積都由水來補(bǔ)足。
4. DNA聚合酶預(yù)混液
a)最后加入體系以保證對存貨（stock）的最小污染，加完后可用槍頭緩慢混勻。
b)直接上電泳的基因分型實(shí)驗(yàn)可以選擇預(yù)混Loading buffer的DNA聚合酶，省去了很多加樣的時(shí)間。

PCR結(jié)束后應(yīng)盡量當(dāng)天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或?qū)a(chǎn)物置于4℃短期保存哦。

稀釋系數(shù)tips：1）10X的溶液20μL體系中加2μL，2X的溶液20μL體系中加10μL；2）4X溶液與4X溶液等體積混合后為2X預(yù)混液（Premix）。

最后劃重點(diǎn)，每次PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)不要忘了包括陰性和陽性對照。

附：可使用到的NEST產(chǎn)品
PCR系列、移液吸頭、微量離心管