導讀

表皮屏障是通過角質形成細胞的干細胞的激活、增殖和分化而恢復的，但其在損傷和老化后通過不明確的機制阻礙了這一修復過程。作者在之前發(fā)現了老年小鼠表皮代謝功能障礙的基因特征，但表皮修復和年齡相關生長缺陷的精確調控機制尚未建立。所以作者使用衰老小鼠模型以及代謝調節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔激活物-1α（Pgc-1α）有條件表皮缺失的小鼠，探索控制損傷和應激后皮膚修復的細胞途徑。

美國東北大學生物系與加拿大渥太華大學生物化學、微生物學和免疫學系聯合研究的研究人員在Molecular Metabolism雜志上發(fā)表了題為《Pgc-1α controls epidermal stem cell fate and skin repair by sustaining NAD homeostasis during aging》的文章。文中的H&E染色結果和免疫熒光結果均應用Echo Revolve 顯微鏡進行顯微成像。

研究亮點：

通過ECHO Revolve顯微鏡對染色的外植體和免疫熒光結果進行成像，得到分辨率高，細節(jié)清晰的圖像，并結合其他結果的分析發(fā)現：

▶   衰老延緩小鼠傷口再上皮化，與Pgc-1α信號轉導降低相關。

▶  表皮Pgc-1α的缺失減緩了愈合，并由于NAD穩(wěn)態(tài)的破壞而減少了增殖。

▶ 低水平的表皮NAD會增強p53生長停滯，但在補充NAD后會逆轉。

▶ 衰老會破壞表皮NAD穩(wěn)態(tài)，但NAD前體可逆轉表皮生長缺陷。

文中所有的H&E染色和免疫熒光結果均是使用Echo Revolve Generation 2顯微鏡進行的快速清晰的成像。揭示了衰老會損傷傷口愈合過程中的表皮再生長，并導致Pgc-1α的表達降低。表皮Pgc-1α有條件缺失的小鼠表現出更大的炎癥和UVB誘導的細胞分化、減少的增殖和較慢的傷口愈合。epiPgc-1αKO小鼠還表現出角質形成細胞NAD水平降低、端粒縮短和多聚ADP核糖化增加，導致應激刺激的p53和p21信號增強。當NAD因Pgc-1α缺失或NAD合成的藥理學抑制而減少時，應激誘導的增殖減少，分化增加，并通過表皮脫落增強保護DNA免受損傷。同樣，老年小鼠表現出表皮NAD穩(wěn)態(tài)紊亂和p53活化增強，導致損傷后p21生長停滯。NAD前體治療可恢復老年皮膚到年輕皮膚的表皮生長狀態(tài)。

研究成果：

▼圖1證明了與年齡相關的傷口愈合和表皮生長障礙與Pgc-1α信號傳導減少有關。

▲ 圖1.衰老導致傷口愈合較慢，表皮干細胞生長受損，與Pgc-1α信號傳導減少相關。（A）損傷后9天內的傷口閉合（右側第9天圖像）和（B）年輕（4月齡）和老年（24月齡）C57 / Bl6小鼠的角質形成細胞生長。使用結晶紫對（B）中的細胞生長進行染色以便于觀察。（C）表皮層分層及其標志物的圖解。（D）傷口損傷后5天，年輕和老年皮膚中角質蛋白-14陽性表皮舌的平均長度。（E）損傷后5天，年輕和老年小鼠愈合傷口基礎表皮前緣右側的EdU細胞。（F）年輕和老年小鼠傷口表皮的代表性圖像。（G）年輕和老年小鼠表皮中Pgc-1α和Pgc-1β mRNA的qPCR數據。（H）與對照相比，急性UVB暴露后24和48小時，年輕小鼠的表皮Pgc-1α mRNA的表達量。

▼圖2證明了表皮Pgc-1α的缺失可減少應激誘導的增殖，增強分化并導致傷口愈合緩慢。

▲ 圖2.表皮Pgc-1α的遺傳缺失在生理性皮膚損傷后減少細胞生長并增強分化。（A）角質形成細胞中cre-lox重組以刪除Pgc-1α的示意圖。（B）7–9 WT和epiPgc-1αKO小鼠的表皮Pgc-1β mRNA（Ppargc1a）。（C）角蛋白14（K14）、角蛋白10（K10）和loricrin（Lor）的代表性圖像。（D）UVB誘導WT和epiPgc-1αKO小鼠中EdU表皮細胞和（E）K10層厚度相對于對照皮膚的折疊變化。（F）UVB暴露表皮中γH2AX和胸腺嘧啶二聚體的定量，右側為5 WT和epiPgc-1αKO小鼠的代表性圖像。（G）TPA誘導WT和epiPgc-1αKO小鼠EdU表皮細胞和（H）K10層增厚相對于對照皮膚的折疊變化。（I）7–8 WT和epiPgc-1αKO小鼠9天后的開放傷口面積。

▼圖3表明Pgc-1α維持表皮NAD穩(wěn)態(tài)，NAD挽救的藥理學抑制促進UVB誘導的分化并防止DNA損傷。

▲ 圖3.Pgc-1α缺失的角質形成細胞破壞了NAD代謝，對NAD合成的藥物抑制足以減少增殖并增強UVB誘導的分化。（A）7–9 WT和epiPgc-1α KO小鼠表皮NAD代謝相關基因的mRNA相對表達。（B）4–5只WT和epiPgc-1α KO小鼠尾部表皮中NAD的相對水平。（C）72小時后，來自年輕皮膚外植體的體外角質形成細胞生長對Nampt抑制劑FK866的劑量反應。（D）C57 / Bl6小鼠中FK866應用與UVB應激相結合的示意圖。（E） 對照手術或UVB暴露48小時后，用局部FK866（100 nM）或載體（Veh；乙醇）處理的每組5–6只小鼠的表皮NAD水平。（F）角蛋白10層級增厚。（G）表皮增殖（EdU）的變化，以及（H）γH2AX陽性表皮細胞的豐度。代表性免疫熒光圖像（F–H）顯示在量化右側。

▼圖4證明了增加Pgc-1a缺失小鼠的NAD水平挽救異常應激誘導的分化并恢復傷口愈合。

▲ 圖4.用NAD前體治療表皮Pgc-1αKO小鼠可加速皮膚愈合并抑制UVB誘導的分化。（A–B）使用4 WT和epiPgc-1αKO皮膚樣品（NAD前體煙酰胺單核苷酸（NMN）、煙酰胺（NAM）或煙酰胺核苷（NR）處理或未處理），角質形成細胞生長為外植體面積的一部分或載體條件的數倍。（C）（A–B）生長出的代表性圖像用結晶紫染色，以便于可視化。（D–F）每天注射賦形劑或500 mg/kg NR的4-7 WT和epiPgc-1αKO小鼠的肝臟NAD、尾表皮NAD水平和傷口完全閉合的時間。損傷后第0天（D0）、第11天（D11）和第13天（D13）的代表性圖像。（G） UVB暴露和NR劑量示意圖。（H–K）用載體或煙酰胺核苷（NR）處理的4只WT和Pgc-1αKO小鼠的UVB暴露表皮中的角蛋白10增厚、γH2AX細胞和胸腺嘧啶二聚體細胞。代表性免疫熒光圖像及量化結果。

▼圖5證實了Pgc-1α的缺失誘導端�？s短，增強Parp活性并增強應激誘導的p53信號傳導。

▲ 圖5.表皮Pgc-1α缺失后的端粒功能障礙以NAD依賴的方式使干細胞對應激誘導的p53活化和核增大敏感。（A）定量6–7 WT和epiPgc-1αKO小鼠表皮裂解物中多聚和單ADP核糖（MAR/PAR）的免疫印跡。（B）4–6 WT和epiPgc-1αKO小鼠的亮染MAR/PAR表皮細胞數量（MAR/PAR+高）。（C）表皮裂解液中泛乙酰賴氨酸的免疫印跡定量。（D）平均表皮端粒長度。（E）5–6 WT和epiPgc-1αKO小鼠的載體和TPA處理皮膚中的核HMGB1細胞和（F）基底層核大小。（G）用載體或煙酰胺核苷（NR，500 mg/kg）處理的WT和epiPgc-1αKO小鼠58小時后，UVB暴露表皮的核HMGB1或（H）p21表皮細胞以及（I）基底層核大小。（J）用局部載體或FK866處理的6只C57Bl/6小鼠中，對照手術和UVB暴露表皮的核HMGB1或（K）p21表皮細胞以及（L）基底層核大小。代表性免疫印跡（A、C）或免疫熒光圖像（B、E、G、H、K）顯示在量化右側。

▼圖6老年表皮表現出NAD穩(wěn)態(tài)紊亂和p21生長停滯增加。

▲ 圖6.衰老破壞表皮NAD穩(wěn)態(tài)并增強p53-p21信號軸。（A）年輕小鼠與老年小鼠表皮NAD的相對水平和NAD代謝相關基因的（B）mRNA表達。年輕和老年表皮中（C）MAR/PAR酰化的免疫印跡。（D）賴氨酸乙酰化和（E）乙�；鵳53（K382）的免疫印跡，右側為定量。（F）年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠損傷后5天，前緣內的表皮p21細胞。右側的代表性圖像，虛線顯示了從箭頭開始的前緣的前1000μm。（G）用所示NAD前體處理72小時的年輕和老年小鼠的皮膚角質形成細胞外植體生長。

通過ECHO Revolve正倒置一體顯微鏡的優(yōu)質成像，得到了所需的高清圖片，不僅用于觀察分析，還可使用tiff黑白原圖進行定量分析，最終得到整個結論。該項研究確定了表皮Pgc-1α通過調節(jié)細胞NAD+和對p53驅動的生長停滯的下游影響，在控制表皮修復中的新作用。另外還發(fā)現，衰老表皮中存在明顯的平行機制，表明NAD信號傳導是生理性皮膚修復的重要控制因素，并且該途徑的功能障礙導致了與年齡相關的傷口修復缺陷。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2212877822001442

期刊介紹：

《Molecular Metabolism》致力于作為一個報告能量穩(wěn)態(tài)以及代謝紊亂（如肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥）的病因、發(fā)展、治療和相關健康后果方面的突破性發(fā)現的平臺。該雜志發(fā)表了以最高標準生成的假說驅動的研究，為對能量穩(wěn)態(tài)相關行為、生理學和功能障礙等機制的理解鋪平了道路。最新影響因子8.568。

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