原理
 

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有"分子篩"和"電泳"的雙重作用。
 

瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質太大，對大多數(shù)蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現(xiàn)廣泛應用于核酸的研究中。
 

蛋白質和核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達10^7bp的DNA片段。
 

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

操作流程

準備干凈的配膠板和電泳槽

注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。

電泳方法

一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以;如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳;用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。

凝膠濃度

對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

電壓和溫度

電泳時電場強度不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象

DNA樣品的純度和狀態(tài)

注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。

凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠(EB)，染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。

回收

DNA片段的膠回收方法

電泳洗脫法

低熔點瓊脂糖凝膠電泳挖塊法

凍融回收法

玻璃奶回收法

柱回收法

膠回收注意事項

將電泳槽用ddH2O反復清洗干凈，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液;

根據(jù)點樣量制備合適厚度的瓊脂糖凝膠板;

切膠時盡可能切掉不含DNA片段的凝膠;

要盡量減少DNA在紫外下的照射時間以減少對DNA的損傷;

熔膠要完全。

切膠時還要注意手臂不要有裸露皮膚，以防被紫外線直接照射，如果有條件的話還可以戴一副防護眼鏡，減少對眼睛的傷害。